AS-PCR技术检测20个mtDNA SNP位点及单倍型频率

目的基于等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)技术,建立一种三色荧光标记复合扩增检测线粒体DNA(mtDNA)SNP的方法。方法基于AS-PCR原理,选择20个mtDNA编码区SNP位点,分为两组,分别标记FAM和HEX荧光,每个位点设计具有长度差异的两条上游(下游)等位基因特异性引物以及一条下游(上游)通用引物。结合AS-PCR技术和毛细管电泳,检测200份无关个体血样。各位点随机选取至少3个样本进行直接测序验证,并进行单倍型频率调查。结果 200份血样均得到清晰分型,各位点的检测结果与直接测序结果完全一致。10μL体系下,DNA最低检测浓度为0.2pg,当模板量为0.5~5 pg时能得到较为理想的分型图谱。在200名无关个体中,共分出15种单倍型,单倍型多样性为0.906 0。结论 AS-PCR技术是一种简单、快速且有效的mtDNA SNP分型方法,适用于法庭科学检验的需求。     

汉族人群DXS9898基因座的遗传多态性

目的研究汉族群体DXS9898基因座的遗传多态性,为法科学应用提供基础数据。方法应用PCR及PAG电泳技术,对成都地区汉族群体199名女性无关个体及97名男性无关个体进行群体遗传学调查。结果共检出6个等位基因,片段大小为189～214bp,其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。家系调查证实等位基因的传递遵循孟德尔遗传规律。女性样本杂合度为0.5930;男、女性样本个人识别能力(Dp)分别为0.5667、0.9420;父-母-女三联体鉴定的非父排除率(PE)为0.5862。结论DXS9898基因座在法科学个人识别及女性小孩的亲权鉴定中具有较高的实用价值。     

运用PCR技术对人骨组织和牙齿进行性别鉴定的应用研究

为了解决刑事案件中利用人骨组织和牙齿进行性别鉴定的问题，我们通过骨骼和牙齿中ＤＮＡ的提取床用Ｙ染色体特异ＤＮＭ列引物扩增Ｙ染色体的ＤＹＺＩ和ＳＲＹ基因序列．结果：１．骨组织中ＤＮＡ的提取可在１小时内完成；牙齿中ＤＮＡ的提取可在４小时内完成；２．牙齿中的ＤＮＡ保存的完好性大于骨组织；４．煮沸过的骨组织中的ＤＮＡ降解严重，无法用于实验．     

17个Y-STR基因座遗传结构及用于姓氏推断的价值

目的调查我国10个姓氏群体Y-STR的遗传结构,探讨其用于鉴定的价值。方法采用AB Y-Filer荧光检测试剂盒,选取我国占人口数量最多的10个姓氏(李、王、张、刘、陈、杨、赵、黄、周、吴),每个姓氏100名汉族男性个体,采用Y-Filer荧光检测试剂盒,检测17个Y-STR基因座的等位基因频率分布和单倍型多样性,计算其遗传距离并比较群体间差异。结果 10个姓氏间单倍型多样性与总的群体单倍型多样性无显著差异,姓氏间与姓氏内的单倍型随机匹配概率差异很小。分析共祖系数Fst以及Reynold’s遗传距离,10个姓氏间任意两个姓氏群体对应17个Y-STR的Fst值均小于0.01。结论中国汉族10个主要姓氏在大的范围内Y-STR不表现出姓氏特异性,不能用Y-STR进行姓氏推断。     

鸡传染性支气管炎病毒real-time PCR检测方法的建立

针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因片段设计并合成了1对引物,将构建的重组质粒作为阳性标准品,成功建立了检测IBV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,该方法的线性关系好,标准曲线的相关系数达0.998 3;最低可以检测到1×101 copies/μL的核酸模板;与常见禽源病毒新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒均不发生交叉反应,重复性试验的变异系数小于3%。应用建立的方法对人工感染IBV的20只试验鸡的40份气管和肾样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,攻毒后第5和第7天肾中病毒含量高于气管,证实了临床表现与病毒载量之间的关系。结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于IBV的病原检测及定量分析。     

猪巨细胞病毒SC株DNA聚合酶基因的克隆及生物信息学分析

为克隆出猪巨细胞病毒SC株DNA聚合酶(DPOL)基因并对其进行分析,根据GenBank中的DPOL基因序列(AF268040)设计了1对引物,用PCR法扩增出猪巨细胞病毒SC株DPOL基因,将其克隆到T载体,测序并进行生物信息学分析。测序结果表明,猪巨细胞病毒DPOL基因全长3 024bp,为一个完整ORF,共编码1 008个氨基酸;与参考毒株的核苷酸同源性为98%,系统进化树表明猪巨细胞病毒与人疱疹病毒6型和7型关系最近;运用生物信息学软件推导出该蛋白的基本性质,并预测出高级结构。成功地进行了猪巨细胞病毒SC株DPOL基因的克隆和生物信息学分析,为今后此基因生物学功能和猪巨细胞病毒复制机理的研究以及病毒系统分类工作提供了参考。     

马鼻肺炎病毒双重PCR分型检测方法的建立

根据GenBank中登录的马鼻肺炎病毒1、4型(EHV1、EHV4)糖蛋白B(gB)基因特异保守序列(登录号分别为AY665713、AF030027.1),各设计1对引物,建立了同时分型检测EHV1、EHV4的双重PCR方法;确定其最佳工作条件,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。结果显示,在EHV1、EHV4中分别扩增出265bp和537bp的特异性目的条带,而马流感病毒cDNA、马动脉炎病毒cDNA、马乙型脑炎病毒cDNA及马传染性贫血弱毒疫苗株cDNA均未扩增出任何条带。EHV1的DNA最低检出限为2.1pg,EHV4的最低检出限为15pg。表明本试验建立的方法具备很高的应用价值。     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

大鼠死后脑、心肌和肾组织β-actin mRNA的降解与早期死亡时间的关系

目的 研究SD大鼠脑、心肌和肾组织细胞内β-actin mRNA的降解与早期死亡时间的关系,为早期死亡时间的推断寻找新的指标.方法 大鼠处死后置于20℃的环境中,分别于死后不同时间点提取脑、心肌、肾的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测总RNA中β-actin mRNA的水平(Ct值),分析死后经过时间与Ct...     

应用RNA分析技术推断现场血痕形成时间

目的检测血痕中β-actin mRNA和18S rRNA在人体死后8～15d期间的表达残留,为推断血痕形成时间寻找新的客观依据。方法在上述时段内每天抽提血痕总RNA,利用实时定量RT-PCR技术监测18S rRNA和β-actin mRNA的扩增状况并对产物进行定量分析,通过检测18S rRNA与β-actin mRNA含量在各个时间点的变化趋势来推测血痕形成时间。结果死后8～15 d时段内18S rRNA与β-actinmRNA量的比值呈明显升高趋势,显示出两种不同类型RNA降解的时间差异性。结论一定时段内18SrRNA与β-actin mRNA量的相对变化,可作为推测血痕形成时间的参考指标。