温州汉族人群D7S2846、D19S400和D18S535基因座的遗传多态性研究

目的研究D7S2846、D19S400和D18S535位点在温州汉族人群的遗传多态性。方法EDTA抗凝血样采自194名无血缘关系温州地区汉族个体,用chelex-100法提取DNA,PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色分析。结果D7S2846观察到6个等位基因及15种基因型;D19S400观察到10个等位基因及36种基因型;D18S535观察到8个等位基因及26种基因型。各基因座的杂合度(H)分别为:0.644、0.724、0.772;个人识别能力(Dp):0.854、0.940、0.938。结论三个STR基因座具有较高杂合度,等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡,在法医学应用和群体遗传学研究中有较高的价值。     

北京汉族群体9个STR位点的频率分布及法医学应用

提供北京汉族群体9个STR基因座的频率分布资料，了解其在法医学中的应用价值。应用PCR技术对9个STR基因座分3组进行复合扩增，经PAG电泳分离、银染，扫描仪扫描，计算机判读并保存结果，对北京地区汉族无关个体9个基因座的基因频率分布进行调查。结果显示，上述9个基因座的杂合度为0．6419～0．8092，多态性信息总量为0．9999，鉴别机率为0．9999，匹配机率为2．0×10-9和非父排除率为0．9985。STR3组9个基因座的综合检验可应用于法医学个体识别和亲子鉴定，并达到同一认定的标准。     

15重快速STR复合扩增体系的构建

目的建立一套15重快速STR复合扩增体系。方法选择14个常染色体基因座以及1个性别基因座,采用Fast Start Taq DNA聚合酶系统,以DNA标准品9947A为模板,通过筛选扩增条件、选择热启动酶用量、调整引物平衡、优化快速扩增程序、筛选反应缓冲液、选择反应体系以及筛选添加剂等一系列复合扩增实验,比较各条件下等位基因丢失和非特异性扩增情况。结果在以1 ng DNA为模板、0.4μL聚合酶及10×Fast Start高保真反应缓冲液构成10μL快速体系的条件下,32 min即可获得标准DNA全部15个STR基因座的完整分型,无等位基因丢失和非特异性扩增现象,等位基因均衡性良好。同时,5%甘油、0.01%明胶、0.05%明胶和5 mmol/L硫酸铵可作为PCR扩增过程中拟加入的反应添加剂。结论本研究建立的15重快速STR复合扩增体系可以明显缩短反应时间,提高样品检测效率。     

鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析

为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较.结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭工菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法.经对亚型分布情况进行分析.表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型.证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析.     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株联合RT-PCR鉴别方法的建立

为了建立快速、有效的鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的诊断方法,根据CDV野毒株与疫苗株N基因的保守区域以及H基因的多变区域设计特异性引物,建立了区分CDV野毒株与疫苗株的联合RT-PCR方法.结果表明,针对N基因的RT-PCR方法能同时检测CDV野毒株与疫苗株;而针对H基因的RT-PCR方法只能检测CDV野毒株,不能检测CDV疫苗株.根据2次RT-PCR反应结果,能够很好地区分CDV野毒株与疫苗株.同时,经过病毒电镜观察和H基因扩增片段的克隆测序结果的比对,进一步确认了该方法的特异性.表明,该方法具有快速、特异、实用等优点,可作为CDV鉴别诊断的有效手段.     

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病(MD)流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒(MDV)Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析.结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%～100%,与MDV Ⅰ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%～99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致.提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征.     

口蹄疫病毒单链抗体基因的构建及其推导蛋白三维结构的分子模拟

用口蹄疫病毒(FMDV)Asial/JS/China/2005株灭活抗原免疫家兔,从兔脾细胞中提取RNA作为模板,通过PCR及重叠PCR方法构建出FMDV的单链抗体基因.测序结果显示,序列中有重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因,经Blast比较,发现VH、VL的相似性最高分别可达81.0%和93.0%,且在序列中有连接VH及VL的柔性接头(Gly_4Ser)_3.用EXPASY软件包预测了推导蛋白的特性.运用Swiss-pdb viewer软件的SWISS-Model处理器对构建的单链抗体基因推导的蛋白序列进行了三维结构的分子模拟.拉马钱德兰图证明,所模拟的单链抗体的三维结构较为合理.     

贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析.结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52 %(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0.病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞.PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段.扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%.结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况.     

旋毛虫43 ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针.以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平.结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫.结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系.     

PCR-RFLP技术对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株的分型鉴定

应用扩增Ⅰ群禽腺病毒(AAV)Hexon基因A片段和B片段的2对引物,对Ⅰ群AAV的12个血清型毒株进行了PCR扩增.结果扩增出的A片段大小为1 219 bp,B片段大小为1 350 bp.对A片段用限制性内切酶HaeⅡ进行酶切,结果得到6种不同的RFLP图谱;对B片段进行HaeⅡ酶切,结果得到9种不同的RFLP图谱.综合分析A片段和B片段的PCR-RFLP结果,能鉴别Ⅰ群AAV的12个血清型.结果表明,建立的PCR-RFLP具有快速、简单、特异、灵敏等优点,可作为Ⅰ群AAV流行毒株血清型的快速分型工具.