口蹄疫病毒单链抗体基因的构建及其推导蛋白三维结构的分子模拟

用口蹄疫病毒(FMDV)Asial/JS/China/2005株灭活抗原免疫家兔,从兔脾细胞中提取RNA作为模板,通过PCR及重叠PCR方法构建出FMDV的单链抗体基因.测序结果显示,序列中有重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因,经Blast比较,发现VH、VL的相似性最高分别可达81.0%和93.0%,且在序列中有连接VH及VL的柔性接头(Gly_4Ser)_3.用EXPASY软件包预测了推导蛋白的特性.运用Swiss-pdb viewer软件的SWISS-Model处理器对构建的单链抗体基因推导的蛋白序列进行了三维结构的分子模拟.拉马钱德兰图证明,所模拟的单链抗体的三维结构较为合理.     

贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析.结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52 %(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0.病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞.PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段.扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%.结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况.     

旋毛虫43 ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针.以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平.结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫.结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系.     

三种贝类原虫多重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫、派琴虫和马尔太虫的基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过对多重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这3种原虫的多重PCR方法.用该技术对同一样品中的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)、596 bp(派琴虫)和478 bp(马尔太虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫DNA,提示该技术适用于这3种原虫的临床快速检测和鉴别诊断.     

西藏那曲地区旋毛虫分离株的分子分类鉴定

从西藏那曲地区旋毛虫抗体阳性藏猪获取膈肌组织,显微镜检查后采用人工消化法收集旋毛虫肌幼虫。提取旋毛虫基因组,以旋毛虫(T.spiralis)和乡土旋毛虫(T.nativa)标准株为对照,应用线粒体核糖体小亚基及大亚基RNA特异引物进行PCR扩增,结果扩增产物为650bp,与T.spiralis一致。对西藏那曲旋毛虫分离株的5SRNA内转录间隔区基因进行PCR扩增及序列测定,与GenBank数据库中已知的旋毛虫序列进行比对分析,确定其分类地位。结果扩增到735bp的片段,与T.spiralis的相似性达到99%,仅有3个核苷酸不同,可以归为一类。结果表明,西藏那曲旋毛虫分离株应该属于T.spiralis。     

12株肉仔鸡包涵体肝炎病毒的分离和PCR鉴定

从临床疑似肉仔鸡包涵体肝炎病例的肝组织中,通过SPF鸡胚连续传代和鸡胚肾细胞培养,分离到12株疑似肉仔鸡包涵体肝炎病毒毒株。通过形态学、致细胞病变和PCR检测等对12株疑似肉仔鸡包涵体肝炎病毒分离物进行了鉴定。结果显示,该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称,直径70～80nm;接种鸡胚后鸡胚肝在不同时期表现不同程度的病变;在鸡胚肾细胞(CEK)上可致细胞病变。根据Ⅰ群禽腺病毒CELO株的Hexon保守区基因序列,设计合成了1对引物。用这对引物对12株病毒的核酸模板进行了PCR扩增,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的508bp片段,序列分析表明,分离株确为Ⅰ群禽腺病毒。从病毒形态,鸡胚及细胞病变以及PCR检测结果,证明12株分离物确为肉仔鸡包涵体肝炎病毒。建立的鸡包涵体肝炎快速PCR诊断方法可用于鸡包涵体肝炎的临床快速诊断。     

武汉汉族群体FOLP23、TPOX及GABRB15基因座遗传多态性研究

目的　研究FOLP2 3、TPOX及GABRB15的多态性及法医学应用价值。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带技术对武汉地区汉族 2 0 0例无关个体作FOLP2 3、TPOX及GABRB15位点分型调查。结果　FOLP2 3、TPOX及GABRB15位点分别检出 6、 5和 5个等位基因 ,获得汉族人群基因频率分布。三位点基因型频率分布符合Hardy -Weinberg平衡。位点杂合度分别为0 6 798、 0 5 6 5 0、 0 6 95 0 ,个人识别能力分别为 0 85 94、 0 6 975和 0 82 6 2 ,非父排除率分别为 0 45 31、0 2 745、 0 40 79。结论 　FOLP2 3、TPOX及GABRB1 5位点均是高杂合度、高鉴别能力的遗传标记系统 ,具有较高的法医学应用价值     

PCR-RFLP技术对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株的分型鉴定

应用扩增Ⅰ群禽腺病毒(AAV)Hexon基因A片段和B片段的2对引物,对Ⅰ群AAV的12个血清型毒株进行了PCR扩增.结果扩增出的A片段大小为1 219 bp,B片段大小为1 350 bp.对A片段用限制性内切酶HaeⅡ进行酶切,结果得到6种不同的RFLP图谱;对B片段进行HaeⅡ酶切,结果得到9种不同的RFLP图谱.综合分析A片段和B片段的PCR-RFLP结果,能鉴别Ⅰ群AAV的12个血清型.结果表明,建立的PCR-RFLP具有快速、简单、特异、灵敏等优点,可作为Ⅰ群AAV流行毒株血清型的快速分型工具.     

应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因文库,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物.用这3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增,结果均同时得到了3条与设计相符的310 bp(NDV)、1720 bp(IBV)和647 bp(ILTV)三重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和10 pg的ILTV DNA模板.     

用聚合酶链反应检测犬传染性肝炎的研究

应用聚合酶链反应(PCR)对人工感染犬传染性肝炎病毒(ICHV)的犬进行定期尿检,并以血凝和血凝抑制试验及病毒分离进行比较.结果证明,用PCR方法可以快速检出排毒的犬,其灵敏度是血凝效价的上百倍.