猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法,采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金,选择15 nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体,对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化,组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测,同时用直接荧光抗体试验和RT-PCR做平行试验。结果显示,用试纸条检测猪瘟病毒,10 min左右即可显示结果,试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT-PCR的阳性检出率依次为36.36%(4/11)、45.45%(5/11)和72.72%(8/11)。表明,用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便,需时短,可以用于猪瘟的流行病学调查。     

西安汉族HLA—DQB基因遗传多态性研究

人类白细胞抗原(HLA)是已知的人类最复杂的多态遗传系统[1],其等位基因的变异不仅是法医学个体识别、亲权鉴定较理想的遗传标记,而且在医学、人类学等领域也具有重要的意义。鉴于我国HLA等位基因多态性群体调查资料尚不够完善,本研究采用目前常用的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交技术(PCR-SSOP),对西安汉族HLA-DQB基因座多态性进行调查,以建立西安汉族HLA-DQB基因座的群体遗传学资料。1材料和方法1.1研究对象182份血样随机采自西安地区无血缘关系健康献血志愿者。1.2主要仪器与试剂HLA-DQB高变区扩增引物序列、探针…     

河南汉族群体6个STR基因座遗传多态性研究

目的　通过研究 6个STR基因座FGA ,TPOX ,D3S135 8,vWA ,D8S1179,D2 1S11的遗传多态性 ,了解它们在河南汉族人群中的多态分布 ,与其他群体进行比较 ,得出遗传距离 ,并了解它在法医学中的应用价值。　方法　采用多聚酶链式反应扩增这 6个基因座 ,采用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染显色分析。　结果　得出这 6个基因座在河南汉族人群中的基因频率 ,并计算得出杂合度、个体识别率、非父排除率 ,与其他群体比较得出进化距离。　结论　这 6个基因座有较高的杂合度 ,并且具有相对遗传稳定性 ,在人群中的分布符合Hardy -Weinberge平衡 ,有较高的法医学价值 ,可以应用于个体识别和亲权鉴定。     

新城疫病毒F_(48)E_8株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ，与预期结果相符。将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因     

用DNA体外扩增法鉴定人类牙髓的性别

牙齿是犯罪及重大意外事故现场最易得到的物证,需对其进行个人识别.本文报导了从人的牙髓中提取DNA,用两对引物Y~(1.1)、Y~(1.2)及A1u~(9.1)、Alu~(9.2)作PCR法进行扩增,7颗人牙均有Alu~(9.1)、 Alu~(9.2) 扩增产物,4例男性牙髓有Y~(1.1)、Y~(1.2)扩增产物,3 例女性牙髓则无,正确地判定了牙齿的性别.     

乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建

应用RT-PCR方法,克隆394 bp的MTP片段,连接到pMD 18-T载体上构建pMD-MTP394重组质粒;应用限制性内切酶ApaⅠ消化重组质粒pMD-MTP394,切下一194 bp的小片段,回收大的线性片段,T4 DNA连接酶连接,成功构建了一个重组的竞争模板质粒pMD-MTP200,为建立竞争性RT-PCR法检测乳牛肝MTP基因mRNA奠定了基础。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

大鼠骨骼肌挫伤后ASCT2 mRNA的表达变化

目的应用实时定量PCR技术检测大鼠骨骼肌挫伤后细胞中性氨基酸载体ASCT2 mRNA表达,分析其与挫伤时间的关系。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型,分别取伤后4、8、12、16、20、24、28、32 h及对照组检材。提取总RNA,逆转录合成第一链的cDNA,以RPL13为内参基因进行荧光定量检测,采用2-△△Ct法比较其与对照组肌肉组织中ASCT2 mRNA的相对表达量。结果损伤组肌肉组织中ASCT2 mRNA在挫伤后12、16h表达量分别为对照组的196.40%和189.15%,损伤后4、8、20、24、28、32h ASCT2 mRNA表达量与对照组相比无统计学差异(P>0.05),说明ASCT2 mRNA在损伤12～16h其表达量较正常组及其他损伤时间组要高,而在损伤20h以后ASCT2 mRNA表达量又降至正常水平。结论大鼠骨骼肌挫伤后32h之内ASCT2 mRNA的表达有一定的时间规律性,可望作为推断骨骼肌损伤时间的指标之一。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。