结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

鸭瘟病毒UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达

为阐明鸭瘟病毒(DPV)UL51基因的特性和功能,根据DPV UL51基因序列设计了1对特异性引物,用PCR方法扩增UL51基因,并将其克隆至pMD18-T栽体上,经双酶切和测序鉴定后,再将该目的片段亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上,得到重组质粒pcDNA3.1-UL51,通过脂质体介导将其转入COS-7细胞;应用实时荧光RT-PCR、Western-blotting和间接免疫荧光法检测UL51基因在COS-7细胞中的转录、表达和定位情况.结果表明,UL51基因在转染后6 h即已开始转录,12 h开始表达,24 h时转录和表达量均达最高峰,之后逐渐降低.该基因在COS-7细胞中表达蛋白的分子质量为33 ku.比预测的分子质量(约27.1 ku)大.间接免疫荧光法显示,该基因产物早期聚集于COS-7细胞的近核区域,晚期位于胞浆和胞核中.     

H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV.使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.990 15(H3HA)和0.999 47(N2NA).检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%.表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.     

猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFRl和TNF-αSYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法.该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102 copies/μL外,其他均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%.应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFRl和TNF-α mRNA的表达水平进行了检测.结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好.     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因的荧光定量PCR方法,根据GenBank上IL-1β、IL-2、IL-6的基因序列,在保守区设计并合成了各自的特异引物,选择β-actin和GAPDH基因为内参,采用SYBRGreen Ⅰ染料法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线分析.结果显示,各基因标准曲线的C_1值检测范围在12～33左右,具有良好的线性关系,r~2均大于0.990.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰.结果表明,建立的鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为从mRNA水平对鸡IL进行定量分析奠定了基础.     

新血清型流行性出血病病毒荧光定量qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒.目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法.本研究建立了新血清型EHDV核酸检测的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和RT-PCR...     

马病毒性动脉炎和马鼻肺炎抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

以基因重组抗原包被96孔板,Eu3+标记兔抗马IgG,建立了马病毒性动脉炎和鼻肺炎抗体的时间分辨荧光免疫分析检测方法,对其特异性、灵敏性、稳定性进行了分析,并与进口ELISA试剂盒和微量血清中和试验进行了比较。结果显示,该方法交叉反应不明显,特异性好,灵敏度高于ELISA方法;该方法的批内和批间变异系数分别为2.68%～4.43%和4.21%～7.25%,Eu3+标记物可稳定保存5个月以上。证实,建立的马病毒性动脉炎和马鼻肺炎抗体的时间分辨荧光免疫分析检测技术灵敏度高,特异性和稳定性好,具有很好的应用前景。     

HPLC-UVD/FLD法测定血中氟乙酸类杀鼠剂

目的采用水相催化衍生化-液相色谱-紫外/荧光检测分析法,检测血中氟乙酸类杀鼠剂。方法血样经乙腈沉淀蛋白后,加入衍生化试剂4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、催化剂四丁基溴化铵,在80℃水浴中衍生化反应120min,衍生产采用液相色谱-紫外/荧光检测分析。结果紫外检测法:氟乙酸根浓度在0.38～38.50μg/mL之间线性关系良好,最低检出限为0.10μg/mL;荧光检测法:氟乙酸根浓度在0.15～15.40μg/mL之间线性关系良好,最低检出限为0.050μg/mL。结论水相催化衍生化-液相色谱-紫外/荧光检测分析方法具有较好的灵敏度、准确性和精密度,可用于实际案例检测。