三种鸡细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡细胞因子SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中三种重要的鸡细胞因子即ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为内参,设计特异引物扩增目的基因。将四种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以四种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010 copies/μL时,四种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.985。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对堆型艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA-Ea3-1E免疫的SPF雏鸡脾中ChIL-12mRNA和ChIL-18 mRNA的相对表达量进行检测,免疫组ChIL-12mRNA和ChIL-18mRNA的相对表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01)。研究结果为ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的定量分析提供了技术平台。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

荧光桃红显现非渗透表面潜血足迹技术研究

目的:研究荧光桃红工作液显现非渗透表面潜血足迹技术;方法:荧光桃红溶解于酒精形成显现工作液,喷涂在遗留常见非渗透表面潜血足迹部位;结果:经荧光桃红酒精工作液处理后,常见非渗透表面潜血足迹产生强烈的亮红色。与传统的潜血显现试剂四甲基联苯胺比较,荧光桃红酒精溶液显现出的潜血印痕花纹更为反差明显,特征突出,且能够有效显现四甲基联苯胺处理后的潜血足迹;结论:荧光桃红酒精工作液能够有效显现出非渗透表面潜血足迹,且能够作为四甲基联苯胺的后增强试剂,若得到推广应用,将能够有效提高犯罪现场上潜血印痕的发现率、提取率和利用率。     

荧光分光光度法测定缴获琥珀酰胆碱的含量

荧光分光光度法快速测定琥珀酰胆碱含量的方法主要通过将样品稀释,以258nm为激发波长,286nm为发射波长进行测定.实验结果表明此方法简便易行,灵敏度高,测试结果准确,重现性好,能够适用于琥珀酰胆碱含量的测定.     

青岛地区汉族人群13个STR基因座的频率分布及法医学应用

目的　调查青岛地区汉族人群无关个体的 13个STR基因座 (D3S135 8、VWA、FGA、D8S1179、D2 1S11、D18S5 1、D5S818、D13S317、D7S82 0、D16S5 39、TH0 1、TPOX、CSFIPO)的基因频率分布 ,研究其遗传多态性及其在法医学个体识别及亲子鉴定中的应用价值。　方法　用美国ABI - 310型遗传分析仪对ProfilerPlus和Cofiler两个系统的 13个STR基因座的复合扩增产物进行毛细管电泳及四色荧光自动分析检测 ,基因分型软件为GeneScanv3.1和Genotyperv2 .5 .2。　 结果　获得 13个STR基因座在青岛地区汉族人群的基因频率分布数据 ,13个STR基因座的PIC >0 .5 ,DP >0 .71,CCE =0 .999999,TDP值接近 1,TPm =1.2× 10 -14 ,家系调查符合孟德尔遗传规律。　结论　ProfilerPlus和Cofiler两个系统的 13个STR基因座在法医学个体识别及亲子鉴定中具有较高的应用价值。     

3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系的构建及应用

目的建立D3S3053、D6S474、D20S482（扩增片段〈150bp）3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系,用于高度降解DNA样本的基因分型。方法采用6-FAM、HEX、TAMRA荧光染料标记D20S482、D3S3053、D6S474基因座上游引物,构建并优化复合扩增体系,在ABI310遗传分析仪上对扩增产物进行电泳分析,Genemapper3．2软件分析产物片段大小并进行分型。采用上述体系对120份河北汉族健康无关个体血样进行检测,并计算群体遗传学参数。比较该体系与ID试剂盒用于高度降解检材的成功率及灵敏度。结果D3S3053、D6S474、D20S4823个miniSTR基因座荧光标记复合扩增分型体系稳定可靠,灵敏度达50pg,用于高度降解检材分析的成功率明显高于ID试剂盒。3个基因座在河北汉族人群中的累积个人识别能力为0．998,累积非父排除率为0．84。结论该系统可用于分析高度降解DNA样本的基因分型,进行法医学个人识别和亲权鉴定。     

荧光复合扩增DXS6804、DXS6799和DXS7132基因座

应用分子克隆技术制备出DXS6804、DXS6799和DXS7132基因座的等位基因分型标准物,通过研究复合扩增技术,构建3个基因座X—STR复合扩增的荧光检测体系。     

大鼠骨骼肌挫伤后细胞间黏附分子-1mRNA表达变化

目的应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测大鼠骨骼肌挫伤后细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecular—1,ICAM-1）mRNA表达。分析其与挫伤时间的关系。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型．分别取伤后0．5、1、6、12、18、24、30h及对照组检材。检材冰冻切片后进行FISH．激光共聚焦显微镜观察。结果大鼠骨骼肌挫伤后ICAM-1mRNA的表达6h达到峰值,18h下降至对照组的3．46倍．随后继续升高。结论大鼠骨骼肌挫伤后30h内ICAM—1mRNA的表达有一定的时间规律性．可望作为推断骨骼肌早期损伤时间的指标之一。     

GA118-24B遗传分析仪性能验证

通过荧光定量实验选定一系列浓度不同的标准品,分别在国产和进口遗传分析仪上进行平行实验,结果表明二者之间无明显差异,国产遗传分析仪的主要技术指标能满足检案需求。     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。