毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,用Trizol试剂提取毒害艾美球虫孢子化卵囊总RNA,采用SMART技术,在逆转录酶的作用下将总RNA反转录成第一链cDNA,经LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA).经蛋白酶K消化、Sfi I酶切,过CHROMA SPIN-400TM柱去除小于400 bp的片段,与?TriplEx2TM噬菌体载体连接,用Gigapack ⅢGoldTM载体蛋白包装,构建了cDNA噬菌体表达文库.经测定,原始文库容量为4.72×106pfu/mL,扩增后的文库容量为2.62×1010pfu/mL,重组率为97.5%,插入片段为500～1100 bp.证实,该文库质量良好,为毒害艾美球虫新基因的筛选、克隆及功能研究奠定了基础.     

鸡IFN-γ基因在大肠杆菌中的表达及表达产物对鸡的免疫保护

将鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)成熟肽基因编码区序列亚克隆到原核表达载体Pqe30上,并转化大肠杆菌M15感受态细胞.经诱导后,以镍金属亲和层析法对表达蛋白进行纯化,采用SDS-PAGE与Western-b1ot对表达蛋白进行鉴定.结果显示,经诱导的转化子在体外获得了高效表达,表达蛋白约占菌体蛋白的23%.0.5 ng/Ml以上的重组ChIFN-γ(rChIFN-γ)能显著抑制鸡新城疫病毒对细胞的侵染与伤害;但是,细胞先感染病毒后,再以不同剂量rChIFN-γ作用于细胞,则不具有对细胞的保护作用,说明rChIFN-γ对细胞的保护是通过调节机体免疫能力、干扰病毒入侵实现的.1 ng/ML的rChIFN-γ可显著提高新城疫疫苗的免疫效价,具有较强的免疫协同作用.表明,原核表达的rChIFN-γ具有显著的生物学活性.     

宁都黄鸡脾与法氏囊组织结构及肥大细胞分布的研究

为了解宁都黄鸡主要免疫器官的显微结构与机能特征,采用制作石蜡切片和HE染色的方法观察了宁都黄鸡脾与法氏囊的组织结构;应用改良甲苯胺蓝染色法鉴定了其肥大细胞的分布。结果显示,脾结构由被膜和实质构成,被膜伸入实质形成不发达的小梁,实质包括红髓和白髓。红髓位于白髓周围,分脾索和脾窦;白髓贯穿整个脾,包括动脉周围淋巴鞘以及少量脾小结。法氏囊壁结构可分为黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜。固有层为法氏囊最厚的一层,其内含有许多排列紧密的淋巴小结样结构。肥大细胞经染色呈紫红色,脾中的肥大细胞体积较小,主要分布于红髓和白髓交界处;而法氏囊中的肥大细胞大小不一,形态多样,主要分布于黏膜下层。结果表明,宁都黄鸡的脾和法氏囊与其他家禽的同种器官具有一定的结构相似性,其肥大细胞具有异质性,对宁都黄鸡的疾病防御具有重要作用。     

鸡Toll样受体3基因全长的扩增及生物信息学分析

利用RT-PCR方法从广西三黄鸡外周血淋巴白细胞中扩增出鸡Toll样受体3基因(TLR3),进而对其进行序列分析和结构预测。结果显示,扩增出的TLR3基因全长为3 036bp,与GenBank中鸡TLR3序列同源性达96.5%～99.7%,突变主要集中在胞外区前173个氨基酸;与牛、鼠、绵羊、猪、马、家兔、黑猩猩、人、大猩猩的氨基酸同源性较低,为68.0%～74.8%;禽类TLR3与其他动物类及人类的TLR3分属于两大不同分支,处于不同进化位置;结构预测表明,GX-sh-chTLR3具有明显的跨膜蛋白结构,胞外区蛋白是由外侧多个α螺旋和内侧凹陷的多个β折叠构成螺线管状马鞍形结构,胞外区含有15个明显的富含亮氨酸的重复序列。结果表明,成功扩增出的鸡TLR3基因编码蛋白的空间结构特征明显,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

鸡源致病性沙门氏菌新近分离株的耐药性与耐药基因

为了了解河南省鸡源沙门氏菌新近分离株的药物敏感性和耐药基因的存在情况,为进一步研究细菌耐药的分子机制和新型抗菌药物的研制提供资料,利用K-B法检测了98株鸡源沙门氏菌对22种药物的敏感性,采用PCR方法检测了13种常见耐药基因在分离株中的分布情况。结果显示,所有菌株对红霉素、青霉素、阿齐霉素和氨苄西林的耐药率均在60%～100%之间。三重以上耐药的菌株高达96.94%,七重以上耐药的菌株为56.12%,耐药最多的菌株可耐受18种抗生素。从13种常见耐药基因中扩增到3种四环素类、2种氨基糖苷类、2种β-内酰胺类、1种氯霉素类和3种磺胺类耐药基因。研究表明,沙门氏菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。     

多黏菌素对鸡血液中SOD活性及丙二醛含量的影响

给鸡饮服不同剂量多黏菌素B,在不同时间测定了血浆中过氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果表明,给鸡饮服多黏菌素后,低剂量组鸡于8d后血浆SOD活性明显升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),且保持较低的水平;中、高剂量组鸡分别于给药后第4、第1d血浆SOD活性显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),随后血浆SOD活性均降低而MDA含量升高。说明低剂量多黏菌素能提高鸡血浆中SOD的活性,增强机体的抗氧化能力;但高剂量或长期给药,鸡血浆中SOD活性下降而MDA含量升高。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

温度对鸡早熟艾美球虫孢子囊形成的影响

从混合鸡球虫卵囊中分离单卵囊,感染增殖后收获大量单一种类球虫卵囊,将卵囊分别置于10~36℃、38~39℃、40℃恒温箱内培养,研究了温度对鸡早熟艾美球虫孢子囊形成的影响。结果显示,10~36℃时,孢子囊形成时间随温度提高而提前,每小时孢子囊形成率和增长幅度也随温度的提高而上升。10℃时,77 h初次形成孢子囊,孢子囊形成率达19.047%,经98 h孢子囊形成率达92.360%;36℃时,5 h初次形成孢子囊,孢子囊形成率达26.471%,经8 h孢子囊形成率达94.180%;38~39℃时,孢子囊形成率达一定时就不再上升,且随温度提高孢子囊形成率反而下降。38℃时,最高孢子囊形成率为52.800%,39℃时最高孢子囊形成率为12.500%;40℃时,球虫卵囊不会形成孢子囊,39~40℃是球虫卵囊形成孢子囊的临界温度。将卵囊分别置于40~65℃恒温干燥箱内经0.5 h处理后又经25~30℃培养24 h的结果表明,卵囊经40~50℃处理后仍可形成孢子囊,而经55℃以上温度处理就被杀死,45~50℃是球虫卵囊的生死临界温度。