犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒(CPV)VP2蛋白基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET-30a载体中,构建了原核表达载体pET-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白,Western-blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15.8 ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶100,建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

线粒体16srRNA和ND4基因在种属鉴定中的应用研究

目的构建一种用于种属鉴定的线粒体DNA(m tDNA)16 srRNA和ND4基因荧光标记复合扩增检测体系。方法利用引物设计软件(Prim er 5)对两个m tDNA序列ND4基因和16 srRNA基因设计两对引物,每对引物中的一条在5’端标记荧光素(6-FAM)。按传统复合扩增技术建立复合扩增体系,用AB I PR ISM 310基因分析仪对产物进行分析。结果人类DNA扩增产物出现两个峰,片段大小分别为110bp的人类特异片段和149bp的人与动物共有片段,而动物DNA扩增产物出现一个峰,片段大小为149bp。对30个实验室存放5~15年的陈旧人血痕也能明确判断其种属来源。结论该体系可以明确区分人源性生物检材与其它常见动物样本,对实验室长期存放的陈旧检材也具有较好的检测能力。     

基因专利保护的利弊分析

基因专利保护的问题由来已久,而争论的焦点大多集中在基因是发明还是发现的问题上。实际上,基因是发明还是发现并不是基因是否应该受专利法保护的关键。任何制度的设计都是为了促进社会发展的,如果用专利制度保护基因利大于弊,能够更好地促进基因技术的发展,就应该授予基因专利权,否则就不应该授权。通过分析可以得出,基因应该属于发现,但是以专利制度保护基因利大于弊,所以我国应该授予基因专利。     

J亚群禽白血病病毒Hrb-1和JL-2株囊膜基因的克隆及遗传分析

采用特异性检测J亚群禽白血病病毒的RT PCR方法 ,自哈尔滨市及吉林省患病鸡群中分离鉴定出 2株J亚群禽白血病病毒 ,分别命名为Hrb 1和JL 2。 2株病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖 ,获取其前病毒DNA。采用依据原型毒株HPRS 10 3cDNA序列设计并合成的 1对引物 ,进行PCR扩增 ,得到了JL 2和Hrb 1的囊膜基因。分别构建了重组质粒 pMD18 T JL2 /env和pMD18 T Hrb 1/env。在对 2株病毒囊膜基因进行序列测定的基础上 ,将囊膜基因中 gp85和 gp37的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析 ,结果表明 ,JL 2和Hrb 1分别与美国病毒株adol hc 1和UD3有着较大的亲缘关系。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

猪白介素-18基因的克隆及其序列分析

通过对猪PBMC刺激诱导 ,提取总RNA ,然后采用RT PCR技术克隆了猪白介素 18(pIL 18)基因。序列分析结果表明 ,克隆的 pIL 18基因序列与GenBank上登录的 pIL 18基因序列完全一致 ,与其他各物种的IL 18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL 18的进一步研究和开发奠定了基础     

嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析

研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以 4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及 2株敏感菌株为模板 ,参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列 ,设计了 1对引物 ,进行 gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增 ,将扩增产物克隆入pMD1 8 T载体 ,转化入大肠埃希氏菌DH5α中 ,小提质粒 ,酶切鉴定 ,测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列 ,发现耐药菌有 5个氨基酸突变位点 ,分别是 83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,1 74位点的Ile→Phe,2 0 2位点的Asn→Asp ,2 0 3位点的Leu→Arg ,耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。 83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致 ,1 2 2位点具有保守的Try。     

L-PGDS基因在大鼠睾丸与附睾中的表达

选用 2月龄SD大鼠睾丸与附睾总RNA为模板 ,运用RT PCR和蛋白质印迹技术探讨了Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS)基因在大鼠睾丸与附睾头、附睾体和附睾尾中的表达及其差异。结果表明 ,L PGDS基因在大鼠睾丸中没有表达 ,在附睾中有较强表达 ,附睾头表达量最高 ,附睾体次之 ,附睾尾最低 ,表达量存在差异。提示 ,L PGDS在精子成熟过程中起着一定的作用。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。