以平安促和谐 以稳定促发展——安徽省怀宁县平安建设工作纪实

正安徽省怀宁县位于皖西南交通要塞,东临安庆,南枕长江。自东晋建县以来,已有1600多年历史,省、府、县同城而治达700余年,史称安徽的"首府首县"。这里人文荟萃、俊才辈出,曾孕育了"千年一人"清代书法大师邓石如、中国共产党创始人之一陈独秀、"两弹元勋"邓稼先和现代著名诗人海子等杰出英才。     

猴源环孢子虫的分离与分子鉴定

采用饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法和孢子化试验首次从广东某猴场的猴粪中分离到疑似环孢子虫卵囊。为了对其进行分子鉴定,采用巢式PCR和普通PCR方法,针对环孢子虫属18SrDNA和ITS基因设计了3对引物,扩增其目的片段,并进行了序列分析。结果显示,卵囊大小为7.5～10μm,经改良抗酸染色的卵囊染色程度不一,孢子化卵囊内含2个孢子囊,每个孢子囊内含有2个子孢子。通过PCR扩增,获得的18SrDNA目的片段长712bp,测序结果表明该猴源环孢子虫18SrDNA基因与Cyclosporacolobi、狒狒环孢子虫、人环孢子虫的相似率较高,在进化树上位于同一分支。获得的ITS-1+片段长760bp,其中ITS-1序列高度特异,在GenBank中未见同源性序列。结果表明,从猴粪中分离的疑似环孢子虫卵囊应属于环孢子虫。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。     

鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建

为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。     

缺失信号肽和跨膜区的PRRSV GP5融合蛋白基因的表达

通过分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株GP5基因序列,设计了2对引物,经PCR扩增,获得不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121 bp和248 bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将2段基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组表达质粒pET-GP5。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得高效表达。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白能与特异性血清抗体反应,表明表达的PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性。     

鸡马立克氏病肾肿瘤p15基因的甲基化特异性PCR检测

选取300只1日龄公鸡,人工复制鸡马立克氏病(MD)模型,随机分为对照组和MD组,分别于35日龄、40日龄、45日龄采取鸡肾,观察病理组织学变化,通过甲基化特异性PCR方法,检测了MD病鸡肾肿瘤发生和发展过程中p15基因甲基化的变化,以探讨p15基因甲基化与肾肿瘤发生、发展的关系。结果显示,MD组鸡的临床表现以及肾组织的病理变化符合MD的特征,说明人工复制MD模型成功。在正常鸡肾组织中没有发生p15甲基化,在MD病鸡肾组织中p15甲基化的发生率高达61.7%,与正常对照组差异极显著(P0.01),并呈时间效应。证实,p15基因甲基化与MD的发生、发展密切相关。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

猪戊型肝炎病毒swCH196株ORF3基因的克隆与序列分析

为分析猪戊型肝炎病毒的基因特征,设计了1对套式引物,利用RT-PCR方法克隆出了猪戊型肝炎病毒甘肃分离株swCH196的ORF3基因cDNA片段。序列测定结果表明,swCH196株的ORF3基因长345bp,编码114个氨基酸,与GenBank中登录的其他毒株的核苷酸序列同源性为83.5%～97.7%,系统发育进化树分析结果表明,该分离株为基因Ⅳ型。     

A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)基因的原核表达和免疫原性分析

为研究A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)蛋白亚单位疫苗在鸡体的免疫保护力,利用笔者所在实验室已构建的含M2e基因的质粒pGEM-T-1459,获得顺次串联的基因片段3M2e,将其克隆到原核表达载体pMAL-C2x中,经酶切和DNA测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,表达出一分子质量为60 ku的可溶性融合蛋白(MBP-3M2e),与预期值相符,该蛋白表达量约占菌体表达量的59.8%。间接免疫荧光和间接ELISA检测结果显示,用纯化后的融合蛋白免疫的SPF鸡血清可与流感病毒的M2蛋白发生反应,且其抗体效价较高,表明纯化后的重组融合蛋白具有良好的免疫原性。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.