猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

单位点DNA探针在早孕期亲子鉴定中的应用研究

本研究利用限制性片段长度多态性分析技术，从3O例早孕期绒毛组织及其父母血液中提取DNA，以两种单位点DNA探针PAC255及PAC256进行检测，根据所获等位基因的大小，查国人此二位点基因频率及每一家系三组合中该基因传递相对机会，计算出相应的亲子关系指数和亲子关系概率。结果．累积条子关系指数和累积亲子关系概率的范围分别是56．80～8333.50和98.27～99.99％、按照国际通用标准，这30个家系中，可以肯定亲手关系者20例（66.7％），极可能有亲子关系者8例（26.7％），非常可能有亲子关系者2例（6.7）。说明同时使用此二单位点探针，在早孕期亲子鉴定中有很高的应用价值。     

边缘无浆体病诊断方法的研究进展

综述了边缘无浆体病的常规病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学检测方法的国内外研究现状和发展水平,并探讨了核酸探针、PCR和反向线状印迹杂交技术在边缘无浆体病诊断中的应用及研究进展.     

O157:H7型大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比.结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍.用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性.     

猪流感病毒一步法荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

为了建立一种在猪流感流行病学调查和临床诊断中应用的快速高效的诊断方法,根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)M基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条特异性TaqMan探针,建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法。使用含有M基因的重组质粒作为标准品绘制标准曲线,该曲线效率值为2.014,误差值为0.005。试验结果表明,该方法灵敏度极高,最低可检测到10 copies的核酸;临床样品检测结果也显示其灵敏度高于普通PCR和病毒分离法;特异性强,对猪群常见的其他6种病毒检测结果均为阴性。临床样品检测显示,该方法操作简单,可以用RNA作为模板直接检测,节省时间,而且特异性好、灵敏度高,是可以应用于猪流感流行病学调查的一种可靠的诊断方法。     

地高辛标记质粒探针监测大肠埃希氏菌对四环素抗药性的研究

用Ｂａｍ Ｈ Ⅰ和Ｎｒｕ Ⅰ双酶切质粒ｐＢＲ３２２ 的四环素抗药基因,经ＤＮＡ 纯化回收试剂盒和低融点琼脂糖挖块法回收纯化６００ ｂｐ 的目的基因片段;以随机引物法用地高辛进行标记,制备成探针;用斑点杂交法通过敏感性和特异性试验,证实这种探针用于检测四环素抗药基因是可行的。采用菌落原位杂交法检测了临床分离的７２ 株猪源大肠埃希氏菌四环素抗药菌株,与药敏试验的阳性符合率达９１ ．７ ％ 。     

光生物素标记DNA探针检测传染性喉气管炎病毒感染

用光生物素标记４．３ｋｂ的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＤＮＡ片段作为探针，检测５只人工接种ＩＬＴＶ的ＳＰＦ鸡在不同时期采集的喉拭子样品或血清，并检测采自自然发病鸡群的喉试子样品。结果表明，用核酸探针点杂交方法在人工感染鸡喉气管中检出ＩＬＴＶ的时间为接种后６～１０天；该法敏感、特异，对诊断ＩＬＴＶ感染有实用价值，特别适用于进出口检疫和ＳＰＦ鸡群的监测。     

非同位素标记DNA探针初步研究

本文报导了将辣根过氧化物酶直接标记在单链 DNA 探针上,制备出非同位素的 DNA 探针,采用化学光增强法检测杂交结果,所得图谱清晰,容易判读。所制备出的 DNA 探针可用于人类性别鉴定和个体识别,为 DNA 检验技术推广应用开辟了新的领域。     

HRP标记α-珠蛋白-3′HVR探针进行DNA指纹分析的法医学应用研究

用ＩＩＲＰ标记α－珠蛋白－３′ＨＶＲＤＮＡ探针，化学光增强法检测，获得清晰易读的ＤＮＡ指纹图、分析引名广东地区无关个体的ＤＮＡ指纹图、平均每个个体有１９７条谱带，灵敏度接近同位素３２Ｐ标记探针的水平．两个无关个体间出现同一谱带的相关率为０．２１９。将此方法用于亲子鉴定，取得了令人满意的结果。     

猪脑心肌炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的检测方法,根据GenBank中EMCV 3D基因的保守序列设计并合成1对引物和1条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数达到0.998;敏感性高,检测下限为10copies/μL,比普通PCR敏感100倍;特异性强,只有EMCV呈阳性,而与猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、BHK-21正常细胞均无交叉反应;重复性好,组内与组间的变异系数均小于1.5%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠的脑、心、脾中的病毒载量进行了检测,同时对临床采集的153份可疑病料进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的检测及定量分析。