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81.
根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。 相似文献
82.
83.
为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。 相似文献
84.
以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。 相似文献
85.
采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。 相似文献
86.
为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。 相似文献
87.
88.
89.
90.
通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。 相似文献