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411.
412.
根据GenBank中牛CD80和CD86基因的序列,在保守区设计并合成各自的特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子CD80和CD86的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将CD80基因和CD86基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明,CD80基因、CD86基因和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102~1×108 copies/μL范围均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。证实,所建立的牛共刺激分子CD80和CD86荧光定量RT-PCR检测方法适用于临床样品的检测。 相似文献
413.
通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。 相似文献
414.
为了解四川省黑热病疫区黑水县、汶川县、九寨沟县、茂县和北川县2010年利什曼原虫的家犬感染情况,采用荧光定量PCR反应检测自上述地区采集的584头份犬前肢静脉血样本。结果显示,总阳性检出率为18.1%,其中黑水县25.3%、汶川县24.7%、九寨沟县24.6%、茂县12.3%、北川县8.3%。按照性别、年龄差异将样本分组后对检测结果进行数据统计分析、比较组间差异,结果显示性别组阳性检出率没有显著差异(P>0.05),雄性高于雌性;年龄组差异显著(P<0.05),1岁以上犬易感。检测结果对正确预测四川省黑热病疫区疾病流行趋势,保障人民健康安全和公共卫生安全具有指导意义。 相似文献
415.
猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引:3,自引:1,他引:2
为建立一种检测猪γ-干扰素(IFN-γ)的荧光定量RT-PCR方法,针对猪IFN-γ基因和管家基因cyclophilin A(CyPA)的核苷酸序列分别设计了特异性引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-IFN-γ和pMD18-T-CyPA为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建猪IFN一γ mRNA和CyPA的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果表明,建立的方法在1×101~1×107copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2均高达0.999,扩增效率均高于99.0%;可检测至少为100 copies的阳性标准品.该方法具有快速、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可应用于临床样品的检测. 相似文献
416.
采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应检测了重庆地区牛和猪各50例外周血单核细胞中博尔纳痛病毒(Borna disease virus,BDV)p24基因片段,并对其进行BDV p40基因片段的检测以确保结果的可靠性.检出的阳性序列与GenBank中5个国家4个动物种属25例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列的同源性,重建基因系统发生树.结果显示,3例牛和2例猪血标本BDV p24检测呈阳性,阳性率分别为6.00%和4.00%;5例标本BDV p40片段检测均为阳性,其余标本均为阴性;BDVp24扩增产物序列与BDV标准病毒株He/80的同源性为100%,与H1766和Strain V相比,变异程度小,所编码的氨基酸序列亦无变化;从发生树可以看出,5例BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系.提示,重庆地区牛和猪中可能存在BDV的自然感染,其流行株可能源于外来疫病病原的传入. 相似文献
417.
应用实时荧光定量PCR法对11株鸡源环丙沙星诱导耐药沙门菌和11株人源临床环丙沙星耐药沙门菌的调控基因marA、soxS、ramA和外排泵基因acrA、acrB的mRNA表达水平进行了检测和分析.结果表明,11株诱导株与诱导母株相比,marA、soxS、acrA和acrB的mRNA表达量均显著增加(P<0.05),ramA表达量未增加;11株人源临床耐药株与标准菌株相比,marA、acrA和acrB的表达量显著增加(P<0.05),soxS和ramA的表达量未增加.提示,鸡源诱导株AcrAB过表达与marA和soxS过表达相关;人源临床株AcrAB过表达与marA过表达相关,而与soxS和ramA表达不相关. 相似文献
418.
为建立同时检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)的方法,通过对引物和探针筛选、反应体系和条件优化,成功建立了检测IBRV和BPIV3的双重荧光定量PCR方法。该方法只能特异性地检出IBRV和BPIV3,而对其他无关病原均不能检出;批内和批间变异系数均小于3%;对IBRV和BPIV3质粒标准品的检测下限分别为15.2 copies/μL和18.3 copies/μL。用建立的方法对采自四川、重庆、河北、安徽和吉林这5个地区的143份肉牛呼吸道疾病综合征(BRDC)样本以及四川省和青海省的59份牦牛BRDC样本进行检测,结果显示,肉牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为42.66%和39.86%,混感率为22.38%;牦牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为44.07%和30.51%,混感率为18.64%。上述结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有特异性和稳定性好、灵敏度高的特点,适用于临床上对IBRV和BPIV3的快速检测,临床样本的检测结果丰富了国内IBRV和BPIV3的流行病学资料。 相似文献
419.
为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×101~7.2×108 copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×100copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。 相似文献
420.