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为快速检测鸡细胞的增殖能力,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,建立鸡Akt基因mRNA的定量分析方法。根据GenBank中原鸡Akt基因和鸡β-actin基因序列,设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从DF-1细胞中扩增出目的基因的DNA片段,并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin。分别以重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin为标准品建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测的标准曲线。结果显示,建立的RT-PCR标准曲线具有良好的线性关系和特异的单个峰,能够对样品进行稳定可靠的定量检测。采用本方法检测DF-1-PrP和DF-1-count细胞系的Akt基因的相对表达量,前者为1.656 9×103,后者为2.257 4×102,DF-1-PrP细胞系的Akt基因表达量明显高于DF-1-cont细胞系(P0.01),说明PrPC及Akt在DF-1细胞系中的表达量呈正相关。结果表明,本研究建立的鸡Akt RT-PCR检测方法能够通过对Akt基因的转录量进行检测而评价鸡细胞的增殖能力。 相似文献
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忘海西行:我们可以做得更多我的故乡在南中国海的一个小渔村,当年选择参加西部计划时,我想起一个人——谭嗣同。他十八岁那年,放浪于西北苦寒之地,赋《望海潮》一首,其中几句我一直记得:"拔剑欲高歌,有几根侠骨,禁得揉搓?忽说此人是我,睁眼细瞧科。"此诗做毕,他已不再是一个吟风弄月青衣过市的瘦弱书生。借谭复生的往事开启文端,我只是想说明一件事:步入青年时代的我一直执着于和少年时代的旧梦重逢,这种重逢时常 相似文献
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115.
116.
为了评价重组禽痘病毒rFPV-VP3-F的遗传稳定性,将rFPV-VP3-F在鸡胚成纤维细胞(CEF)连续培养20代.对第5、10、15和20代病毒的F基因进行扩增及序列分析,未发现F基因发生氨基酸改变;通过间接免疫荧光方法检测各个代次rFPV-VP3-F中F基因特异表达的情况;将rFPV-VP3-F和禽痘病毒FPV017分别接种于35日龄商品鸡,在免疫后第7、14、21、28、35 d采集各组血清,检测中和抗体效价.结果显示,F基因在重组禽痘病毒中可以稳定遗传,可在CEF中表达相应蛋白,可刺激鸡产生相应的抗体. 相似文献
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118.
采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。 相似文献
119.
为建立鸡Toll样受体2(ChTLR2)信号通路中相关分子的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中TLR2信号通路中的5种相关分子即ChTLR2-1,ChTLR2-2,ChTLR6,鸡骨髓分化蛋白88(ChMyD88)及鸡核因子κB(ChNF-κB)基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为参考基因,设计特异引物扩增目的基因片段。将6种基因克隆至pMD8-T载体后得到各自的阳性克隆质粒,以6种阳性质粒为标准品建立了标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验分析。应用建立的方法对堆形艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA/Ea3-1E免疫SPF雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA的转录水平进行检测。结果显示,当标准品稀释度为1×102~1×1010copies/μL时,6种基因Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.995。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。免疫雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA转录水平的检测结果表明,免疫组2种分子mRNA转录水平均极显著高于空白对照组(P<0.01)。本研究为ChTLR... 相似文献
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