猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

一株致猪胃溃疡大肠杆菌的分离鉴定

四川某猪场暴发保育猪与育肥猪水样腹泻,病理剖解可见胃黏膜大面积脱落、胃溃疡等症状,采集病死猪扁桃体与肠系膜淋巴结进行病毒检测;以肠内容物做寄生虫卵检测;选取其中一代表病例做细菌分离,经小鼠致死试验、仔猪回归试验确定病原菌,并对病原菌进行了形态学观察、生化鉴定、16SrDNA序列分析及药敏试验。结果显示,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等的检测结果为阴性;无寄生虫感染;从十二指肠内容物中分离到1株疑似致病性大肠杆菌,并命名为SCDC-1。用SCDC-1株人工感染健康仔猪成功复制出水样腹泻、胃溃疡病例。对SCDC-1株进行16SrDNA克隆测序,并与GenBank中的8株肠杆菌科和4株巴氏杆菌科菌株的16S基因进行同源性分析,发现SCDC-1株与大肠杆菌16S基因的相似性高达99.5%～99.9%。药敏试验结果显示,该病原菌仅对头孢曲松钠、头孢吡肟、丁胺卡那霉素敏感。试验结果证实,引起此次保育猪与育肥猪胃溃疡的主要病原为致病性大肠杆菌。     

反向遗传技术及其在猪传染性胃肠炎病毒研究中的应用

对反向遗传学技术及其在RNA病毒研究中的应用进行了综述。论述了猪传染性胃肠炎病毒反向遗传技术的发展现状,并对该技术在猪传染性胃肠炎病毒的基因功能、致病机理、基因工程疫苗研究中的应用及前景等方面进行了探讨。     

减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。     

猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。     

三个猪戊型肝炎病毒ORF2基因连续片段核酸疫苗的构建

为了研制猪戊型肝炎(HE)基因工程疫苗,设计引物扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)的基因片段LB1、LB2、LB3,分别与真核表达载体pEASY-M1Expression Vector直接进行T-A连接,构建得到了重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3。将这3个重组真核表达质粒分别转染293T细胞,采用实时荧光定量RT-PCR检测目的基因,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果显示,重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3在转染的293T细胞中均可表达一约20.5ku的目的蛋白,且具有良好的HEV抗原性。本试验获得的3个HEV ORF2连续片段的候选核酸疫苗为今后进一步研制HEV核酸疫苗奠定了基础。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

乡镇政府在实现城乡公共服务一体化过程中扮演的角色——从智猪博弈视阈分析

1994年以来的两次税费改革在减轻农民负担的同时,亦大大缩减了乡镇政府的收入来源。在建设社会主义新农村及构建和谐社会的大背景下,实现城乡公共服务均等化已成为客观要求。乡镇政府作为基层政权,是联系“三农”最紧密的基层组织,无疑是这一项工程的主要执行者。针对智猪博弈视阈中的中央、乡镇政府角色,唯有协调好二者关系才能够有效实现城乡公共服务均等化。