应用ELISA检测囊虫病猪循环抗原的研究

本项研究应用McAb以ELISA双抗体夹心法检测以免疫复合物(IC)形式存在于囊虫病猪血清中的循环抗原(CA)。用3.5％聚乙二醇沉淀猪血清中的IC,再经沸水浴破坏IC中的抗体,可以明显提高CA的检出率。病猪血清CA阳性率为100％(113/113),与棘球蚴和细颈囊尾蚴感染的猪血清有交叉反应。     

猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测

应用间接血凝试验对来自甘肃、陕西、宁夏、河南、湖北、湖南和海南7个省(区)的1470份猪血清进行猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测和分型鉴定.结果猪传染性胸膜肺炎平均抗体阳性率为20%,其范围为0-60%;分型鉴定表明,各省(区)的血清型不尽相同,主要为1、3、7型.     

杆状病毒表达的猪传染性胃肠炎病毒钉状糖蛋白在其血清学诊断上的应用

利用从猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ｍｉｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓ），建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群抗ＴＧＥＶ抗体。试验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种ｓｆ９细胞（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）所表达的重组蛋白量在接种后第７２ｈ达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶＳ蛋白Ａ位点的单克隆抗体特异性结合。用阻断ＥＬＩＳＡ检测６８份来自无ＴＧＥＶ感染或ＴＧＥＶ（Ｐｕｒｄｕｅｌ５）免疫的仔猪或母猪血清，结果与ＴＧＥＶ蚀斑减数试验完全相符，灵敏度和特异性均为１００％。同时检测来自ＴＧＥＶ试验免疫猪、美国部分地区猪群、我国进口猪以及我国国内猪群血清６２７份，阳性检出率分别为８２．６１％、６１．６２％、５８．３３％和２９．１０％；用中和试验（微量中和试验或病毒蚀斑减数试验）检测的ＴＧＥ血清抗体阳性率分别为８０．８７％、５９．６０％、５６．１１％和３０．６０％，两种方法对抗ＴＧＥＶ抗体的检出率没有显著差异。     

猪流行性腹泻和传染性胃肠炎弱毒二联疫苗免疫抗体应答的研究

用猪流行性腹泻 (PED)和传染性胃肠炎 (TGE)弱毒二联疫苗 (下称二联苗 )免疫PED和TGE抗体阴性的妊娠母猪 ,仔猪出生后第 7、14、2 1和 2 8d抽取仔猪血样用微量血清中和试验检测血清抗体。结果 ,免疫母猪所产仔猪通过哺乳获得了相当高的血清抗体 ,在出生后第 7d时接近母体的中和抗体水平 ,并随日龄增大而下降。二联苗免疫母猪所生仔猪和相同株的PED、TGE疫苗株免疫母猪所生仔猪的血清抗体变化基本相似。用二联苗免疫PED和TGE抗体阴性的 10日龄仔猪 ,并于免疫后以 7d的间隔 ( 1月龄内 )或半月 ( 1月龄后 )间隔采取血样进行血清抗体检测。结果 ,用二联苗免疫抗体阴性的 10日龄仔猪 ,抗体在免疫后第 2 1d(TGE)或第 2 8d(PED)达到最高值 ,但抗体下降缓慢 ,在免疫后第 5月 ,免疫猪血清中仍能检测出抗体。相同弱毒株的PED和TGE疫苗免疫组的结果与之基本相同。提示 ,PED和TGE弱毒株联合免疫在诱导妊娠母猪和小猪产生抗体以及母猪产后向哺乳仔猪传递抗体方面未见有相互影响的现象。     

产毒素多杀巴氏杆菌在猪萎缩性鼻炎病因中的作用研究——给用醋酸处理或不处理的猪接种产毒素多杀巴氏杆菌引起的鼻腔病变比较

用产毒素多杀巴氏杆菌单独接种到未作任何处理的仔猪鼻腔,细菌被迅速清除,鼻甲骨不发生明显萎缩。对仔猪鼻腔用1％醋酸预先处理2天后,再接种产毒素多杀巴氏杆菌,该菌则可在鼻腔长期定居,引起严重的鼻甲骨萎缩;如再混合感染支气管败血波氏杆菌时,猪萎缩性鼻炎的病理变化和临床指征明显加重。试验结果表明,与支气管败血波氏杆菌一样,某些非传染因素也可促进产毒素多杀巴氏杆菌在猪鼻腔定居,从而导致持续性萎缩性鼻炎的发生。     

猪白细胞介素21基因的原核表达与多抗血清的制备

为了制备猪白细胞介素21(porcine interleukin-21,pIL-21)的多克隆抗体,采用RT-PCR从猪外周血单个核细胞(PBMC)扩增获得pIL-21基因,然后将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)之中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,pIL-21以可溶性蛋白形式表达,分子质量为35ku,具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析纯化,获得纯化的重组蛋白pIL-21。用其免疫BALB/c小鼠制备抗pIL-21血清抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体可与杆状病毒表达的重组Cap-pIL-21、ConA和PHA共刺激的猪PBMC细胞发生特异性反应,ELISA抗体效价可达1∶12 800。上述研究结果为pIL-21的生物学功能研究奠定了重要基础。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

三种猪腹泻病毒性病原多重RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的基因序列保守区,分别设计了3对引物。通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了检测PEDV、TGEV和GAR的三重RT-PCR方法,并对其灵敏度、特异性进行了检测。该方法的最低检测量分别为PEDV 0.24pg、TGEV 2.3pg、GAR 1.5pg;特异性试验显示,它对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪链球菌2型、猪源沙门菌、空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌等均不产生非特异性扩增。利用该方法对采自四川省6个猪场的46份样品进行检测,结果,PEDV阳性率达76.1%,TGEV阳性率为19.6%,而GAR未被检出;表明同场样品中存在PEDV与TGEV的混合感染。同时用文献报道的单一RT-PCR法对上述样品进行检测,结果符合率均为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较高的灵敏度和特异性,可用于PEDV、TGEV和GAR的检测。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。