人体脑组织RNA表达水平与早期PMI的相关性

目的探讨人体脑组织多种RNA指标的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性。方法选取12例已知PMI(4.3~22.5 h)的个体,提取脑组织总RNA。选取8种常用RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b),通过实时荧光定量PCR技术检测其在脑组织中的表达水平。运用geNorm软件筛选早期PMI表达稳定的内参指标,并分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死亡原因)的关系。运用R软件将内参标准化的RNA指标代入前期研究建立的数学模型推断PMI,计算推断PMI的误差率以验证模型精确性。结果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表达稳定,其表达水平与年龄、性别、死亡原因无关。利用β-actin推断PMI的误差率为24.6%,GAPDH为41.0%。结论 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表达稳定,适合作为人体脑组织的内参指标。β-actin表达水平与PMI相关性良好,有望成为推测早期PMI的辅助指标。     

2021—2022年我国鸡马立克病的流行病学调查

为了解我国规模化养殖场中马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）的感染和免疫状态,采用四重TaqMan探针荧光定量PCR对采自我国11个省（自治区、直辖市）的19个养殖企业的94个鸡群的羽毛囊和环境样本进行MDV疫苗毒和野毒检测。结果显示,大部分养殖场存在野毒感染,其中山东地区样本平均阳性率较高为13.6%。不同省市白羽肉鸡、黄羽肉鸡和蛋鸡样本的野毒平均阳性率分别为8.3%、3.9%和7.2%。在不同日龄蛋鸡样本中,1～7、8～14和50～80日龄野毒阳性率较高,分别为12.6%、13.8%和14.3%。此外,单独免疫CVI988疫苗或以火鸡疱疹病毒（HVT）为载体的基因工程重组疫苗（rHVT）以及同时免疫这两种疫苗,均能降低MDV野毒的阳性率,且同时免疫两种疫苗鸡群的野毒阳性率最低。对不同免疫方式下疫苗在羽毛囊中复制情况的检测结果显示,在3～4周龄时,单独免疫CVI988疫苗的平均阳性率为91.4%,单独免疫rHVT疫苗的平均阳性率为58.2%,同时免疫两种疫苗时,CVI988疫苗和rHVT疫苗的平均阳性率分别为51.8%和36.9%,提示鸡场应切实做好马立...     

D4R在METH诱导小鼠成瘾中的调控作用研究

目的 探讨脑内多巴胺D4受体（dopamine D4 receptor, D4R）对小鼠甲基苯丙胺（methamphetaine,METH）成瘾行为学和分子生物学的影响,综合分析D4R在小鼠METH成瘾过程中的调控作用。方法 首先将C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组（S组）、METH对照组（M组）和D4R配体干预组进行条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）实验,分析D4R配体对METH成瘾小鼠CPP表达的影响;CPP测试结束后立即剥离所有小鼠的脑核团组织（前额叶皮质、伏隔核、海马和中脑腹侧被盖区）,提取RNA进行实时荧光定量PCR检测,分析METH成瘾小鼠各脑区D4R基因表达的差异性。结果 D4R配体对小鼠测试期总活动量无影响,但可以显著促进实验小鼠CPP的表达;METH成瘾小鼠各脑区内D4R mRNA表达水平与S组相比显著增加,D4R配体干预组实验小鼠各脑区D4R mRNA表达水平与M组相比显著降低。结论 本研究发现METH可导致成瘾小鼠相关脑区核团内D4R表达水平代偿性升高,D4R在METH成瘾过程中发挥重要作用。D4R激动剂和拮抗剂...     

猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。     

旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定

根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBR Green染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况.制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况.结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期.天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫.表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性.该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关.     

微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫SYBR Green real time PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测.结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40).表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查.     

全血和血斑蛋白质组学差异分析

目的 研究外周血形成干燥血斑后蛋白质水平的变化。方法 应用液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）和非标记定量（label-free quantification,LFQ）策略进行全血和血斑的蛋白质检测,分别采用R 4.2.1软件limma包和edgeR包筛选差异蛋白质,再进行生物学功能、信号通路和亚细胞定位分析。结果 全血和血斑中分别检测到623个和596个蛋白质,其中31个蛋白质的定量差异具有统计学意义,包括10个丰度在血斑中上调和21个丰度在血斑中下调的蛋白质。结论 全血和血斑中的蛋白质丰度高度相关,两者间蛋白质丰度的改变可能与细胞内源性蛋白和结构蛋白的变化相关。应用蛋白质组学技术可以辅助蛋白质生物标志物的筛选和鉴定,为法医学研究引入新型生物标志物。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。