猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。     

武汉地区犬瘟热病毒H基因的遗传特征及限制性片段长度多态性分析

根据NCBI上登录的犬瘟热病毒序列,设计了1对检测引物,对武汉临床宠物犬的口、鼻、肛门棉拭子样品进行了检测。随机取其中的6份阳性病料,对其血凝素蛋白编码基因进行扩增并测序。序列分析显示,病毒分为野毒和疫苗毒两簇,野毒的分型和地理位置关系密切。预测蛋白序列分析显示,此次分离的毒株与疫苗毒潜在的N连接糖基化位点有很大差异,可能是病毒抗原性变化的原因之一。根据序列分析结果进行了限制性片段长度多态性分析,并初步建立了野毒和疫苗毒的鉴别诊断方法。     

重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性

用PCR方法扩增了狮头鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,并克隆至pET-32a(+)表达载体,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组狮头鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子质量大小约36ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。rGoIFN-α包涵体经过变性、超滤纯化和复性,得到可溶性rGoIFN-α。rGoIFN-α经肠激酶酶切(eGoIFN-α)、亲和纯化获得狮头鹅α干扰素蛋白(GoIFN-α)。rGoIFN-α经Western-blot检测证实是GoIFN-α蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析α干扰素的抗病毒活性,复性后纯化的rGoIFN-α的抗病毒活性达1.42×104U/mg;eGoIFN-α的抗病毒活性达8.23×104U/mg,GoIFN-α抗病毒活性达3.34×105U/mg。结果表明,rGoIFN-α能够抑制新城疫病毒Roakin株在鸡胚成纤维细胞中复制。     

反向表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒Bartha-K61株的构建

为构建以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株为载体的反向表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(rgp)的重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为反向连接,阳性重组子命名为p8AA-EGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/EGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的效价(TCID50)为108.25/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性.     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及其E基因分析

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测猪流产胎儿病料中的乙型脑炎病毒(JEV),并对阳性病料做病毒分离与纯化.通过空斑减数试验测定了分离株和JEV P3株的中和指数.对分离株的prM-E基因进行克隆并测序,将推导的E蛋白序列与GenBank中登录的JEV毒株的E蛋白序列做比较分析.以E基因序列为基础,绘制进化树.结果显示,在检测的9份病料中有3份呈JEV阳性,并分离出1株JEV,命名为HEN0701.经测定,P3株的中和指数为12,分离株的中和指数为2.prM与E基因的序列分析表明,分离株与P3和Beijing-1株的同源性较低,最高仅为87.7%;而与JEV/sw/Mie/40/2004、KV1899、SH17M-07和YN79-Bao83株的同源性较高,最低为96.6%.进化分析表明,分离株属基因Ⅰ型.E蛋白序列分析结果显示,分离株与基因Ⅰ型JEV的E蛋白序列高度同源,且与SH-53、JEV/sw/Mie/40/2004和VN22/Viet Nam/2002/swine blood株的E蛋白序列完全相同,而与基因Ⅲ型JEV的E蛋白序列存在4个共同的氨基酸变异位点.     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

传染性支气管炎病毒S-ChIL-15融合基因真核表达质粒的构建及其体外表达

通过一段编码(G3S)4多肽的碱基linker将传染性支气管炎病毒(IBV)S基因和鸡IL-15(ChlL15)基因连接,构建了pcDNA3.1-IBVS-ChIL-15融合基因重组质粒.将该重组质粒转染Vero细胞,并通过RT-PCR、免疫组织化学及免疫荧光试验对重组质粒的体外瞬时表达情况进行检测.结果显示,成功构建了S-ChIL-15融合基因,转染24 h后能检测到IBVS-ChlL-15融合基因和该融合基因瞬时表达的产物.     

黑龙江省部分奶牛场牛病毒性腹泻病毒感染的血清学调查

为了解黑龙江省奶牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况,采用已建立的BVDV NS3蛋白抗体间接ELISA方法对采自黑龙江省内不同地区的4个奶牛养殖场2006～2008年的1388份血清样本进行了BVDV抗体检测.结果显示,4个奶牛养殖场这3年的平均BVDV血清阳性率分别为54.66%、57.68%和62.90%.提示,在黑龙江省奶牛养殖场中BVDV感染率较高,并且呈逐年上升趋势.