表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞活化CD8+T细胞的非蛋白酶体依赖途径

为研究树突状细胞加工和呈递灭活口蹄疫病毒(FMDV)抗原并活化CD8+T细胞的途径,用灭活FMDV负载经抑制剂预处理的小鼠单核细胞源树突状细胞(MoDCs),与CD8+T细胞共培养,对照为负载FMDV的正常MoDCs与CD8+T细胞.收集上清液,检测γ干扰素(IFN-γ)的含量.结果显示,试验组CD8+T细胞在共培养的...     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

REV感染的SPF鸡免疫器官中免疫相关因子动态变化的研究

先天性免疫反应是机体抵御病原微生物感染的第一道防线.为了解禽网状内皮组织增生症病毒(REV)感染的SPF鸡早期的天然免疫反应,本研究利用qRT-PCR技术检测了REV感染的SPF鸡主要免疫器官中的免疫应答情况.结果 显示,与病毒未感染组相比,感染鸡免疫器官中天然免疫受体TLR3和TLR7和Ⅱ型干扰素IFN-γ以及Vip...     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

反向遗传技术及其在猪传染性胃肠炎病毒研究中的应用

对反向遗传学技术及其在RNA病毒研究中的应用进行了综述。论述了猪传染性胃肠炎病毒反向遗传技术的发展现状,并对该技术在猪传染性胃肠炎病毒的基因功能、致病机理、基因工程疫苗研究中的应用及前景等方面进行了探讨。