表达传染性腔上囊病病毒VP2蛋白重组乳酸菌的构建及其免疫保护效果

为探讨表达传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白重组乳酸菌的口服免疫效果,采用RT-PCR方法扩增了1株IBDV流行毒株的VP2基因,再分别亚克隆到干酪乳杆菌和乳酸乳球菌的表达载体pPG2和PNZ8112中,并分别电转化干酪乳杆菌L.casei393和乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞,构建了重组菌pPG2-VP2/L. casei393和PNZ8112-VP2/NZ9000.分别经20 g/L乳糖和1 ng/mL的乳链菌肽诱导表达后,对菌体裂解物进行了SDS-PAGE和Western-blot分析.结果显示,重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000的裂解物中分别出现大小约为53 ku和50 ku的反应带,大小均与预期结果相符,表明目的蛋白在重组菌中得到了表达.重组菌pPG2-VP2/L. casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000分别口服免疫SPF雏鸡后,均刺激机体产生了特异性抗IBDV VP2蛋白的血清抗体;攻毒保护试验结果显示,其保护指数分别为62.5%和37.5%,表明重组菌免疫雏鸡后,对IBDV的攻击均具有不同程度的免疫保护作用.     

ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀（Co-immunprecipitation,Co-IP）验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹（Western-blot）分析ASFV野生型病毒株（ASFV-WT）、ASFV MGF360-9L缺失毒株（ASFV-ΔMGF360-9L）感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制...     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsAdSPI和TsKaSPI）,联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体Ig G以及Ig G亚型（IgG1和Ig G2a）的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的Ig G和Ig G亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果...     

以免疫活性串联片段FB为抗原检测FMDV抗体的间接ELISA方法

将口蹄疫病毒免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD/TOPO中,得到重组质粒pBAD-FB,将此重组质粒转化到受体菌TOP10中,以不同浓度的阿拉伯醛糖进行诱导,并在不同诱导时间进行采样,经处理后做SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果发现以终浓度为0.02g/L的阿拉伯醛糖进行诱导,4h后表达量可达高峰,其大小约为26ku,扫描结果显示,FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28.9%,能与抗FMDV抗体发生特异性反应,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。将融合蛋白的可溶性组分用500g/LNi-NTA树脂过柱纯化后作为包被抗原,成功地建立了检测血清中FMD抗体的间接ELISA方法。融合蛋白的最佳包被浓度是40μg/mL;标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶160;最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉和PBS;最佳封闭时间为1h。用建立的ELISA方法对采集的118份样品进行检测,并与全病毒包被抗原ELISA、间接血凝诊断试剂盒和UBIVP1抗体检测ELISA试验盒的检测结果比较,证明所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。     

西咪替丁对鸡细胞和体液免疫功能的作用

观察了西咪替丁和左旋咪唑对鸡细胞和体液免疫功能的作用。对２８ 日龄鸡每天分别按２ ．５ 、１０ ．０ 、１００ ．０ 和４００ ．０ ｍ ｇ／ｋｇ 体重西咪替丁或２ ．５ 、１０ ．０ ｍ ｇ／ｋｇ 体重左旋咪唑饮水给药,连用３ ｄ 后再分别肌肉注射绵羊红细胞（ＳＲＢＣ） 和牛血清白蛋白（ＢＳＡ） 或布鲁氏菌（ＢＡ） 抗原。测定外周血淋巴细胞转化率和ＣＤ＋４ ／ＣＤ＋８ 淋巴细胞比值;测定血清ＳＲＢＣ、ＢＳＡ、ＢＡ 抗体效价和血清补体总活性。结果表明,西咪替丁能明显增强鸡外周血Ｔ 淋巴细胞功能,但对Ｂ 淋巴细胞无明显影响;明显升高血清ＳＲＢＣ、ＢＳＡ、ＢＡ 抗体效价;１０ ．０ ～４００ ．０ ｍ ｇ／ｋｇ 体重西咪替丁能明显升高ＣＤ＋４ ／ＣＤ＋８ 淋巴细胞比值和血清总补体活性。西咪替丁与左旋咪唑相比具有非常类似的作用。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

人工感染西伯利亚鲟体内嗜水气单胞菌分布的免疫组织化学检测

将西伯利亚鲟分别经腹腔注射接种嗜水气单胞菌和浸泡在菌浓度为1×107CFU/mL的水体中,腹腔注射组分别于接种后第12、24和36h剖杀,浸泡组分别于浸泡第24、48和72h剖杀,采用免疫组织化学方法检测嗜水气单胞菌在西伯利亚鲟体内的分布。结果显示,注射组在第12h阳性信号首先出现在脾、肾、肝、心肌中;第24h在肠道、肌肉、胃及性腺中出现阳性细胞。浸泡组第24h阳性信号首先出现在脾、肾、肝、心肌中;第48h在肠道、肌肉、胃及性腺中存在阳性细胞。阳性信号主要位于感染细胞的胞质中,偶尔出现在组织间质中。试验证实,嗜水气单胞菌首先侵袭的是脾、肾、肝、心肌、肠道等组织,然后是肌肉和性腺,而脑组织中一直未检测到阳性细胞。     

家兔急性心肌梗死CTnI免疫组织化学实验研究

目的研究CTnI诊断急性心肌梗死的法医病理学意义。方法结扎兔心脏左冠状动脉左旋支的左室支制作心肌梗塞动物模型。应用免疫组织化学法检测心肌梗塞区域CTnI的变化,与HE染色法进行比较。结果早期心肌梗塞组织,HE染色组尚未出现特征性梗死表现,免疫组织化学染色法可见CTnI分布以及含量变化,并且随着时间延长,变化区域扩大,且近心内膜心肌细胞同时出现变化。结论CTnI免疫组织化学检测可以应用于急性心肌梗死的诊断。     

1对同卵双生新生儿DNA甲基化谱差异分析

目的 探索1对同卵双生新生儿之间DNA甲基化谱的差异.方法 应用甲基化免疫共沉淀结合高通量测序法对1对同卵双生新生儿的DNA甲基化谱进行检测,分析基因组DNA甲基化特点及其之间的差异,筛选适用于法医学分析的甲基化位点.结果 两样本各获得7300万原始测序序列(raw reads)数据,与人类基因组参考序列比对,各得到4800万和5000万唯一比对reads,其中大部分分布在重复区域,且在Alu序列分布最为广泛.两样本DNA甲基化富集区域(peak)各检测到257 362条和197 272条,基因组覆盖率分别为6.53％和5.29％,分布在基因组不同区域,以中间内含子区含量最多.分析两样本甲基化差异区域得到2205条差异的甲基化序列,其中595条位于基因区域,1610条位于基因间区,从中筛选出113条序列,用于进一步深入研究其法医学应用价值.结论 本研究初步证实了DNA甲基化用于同卵双生子鉴定的可行性,为筛选同卵双生子DNA甲基化差异位点提供了基础数据.     

增殖细胞核抗原在非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

研究非霍奇金淋巴瘤 (NHL)中 ,增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达水平 ,探讨其与非霍奇金淋巴瘤恶性度的关系。方法 :常规HE染色进行组织学分类 ,利用免疫组织化学 (LSAB法 ) ,确定肿瘤的免疫表型 ,检测淋巴瘤中PCNA的表达。结果 :62例非霍奇金淋巴瘤中 ,低度恶性 3 9例 ,高度恶性 2 3例 ;48例为B细胞淋巴瘤 ,14例为T细胞淋巴瘤。该组病例中 ,PCNA阳性 62例 ,阳性细胞数均 10 %以上 ,PCNA的阳性程度与NHL的恶性度有关 ,在低度恶性组多表现为 +～ , 占 2 5 6% ,而高度恶性组只有 1例为 +, 占 5 2 2 %。 10例淋巴结反应性增生组织中 ,滤泡中心可见少数 (阳性细胞数 <10 % )散在分布的PCNA阳性细胞。结论 :PCNA表达的阳性程度与NHL的恶性度有关 ;PC NA在NHL高度恶性组的高表达提示我们在组织学水平判断NHL的恶生程度PCNA将是很重要的参考标记物