微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白.     

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。     

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测血清特异性GST-mTSST-1抗体的间接ELISA方法,监测了小鼠血清中特异性GST-mTSST-1抗体水平的动态变化规律。方阵试验确定的GST-mTSST-1抗原的最适包被浓度为5.0μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶100,ELISA阳性反应的临界值为D490 nm≥0.219,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性、特异性和较好的重复性,适用于检测特异性GST-mTSST-1血清抗体。     

胸膜肺炎放线杆菌apx I A基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apx I A基因片段,分别构建了大肠杆菌表达栽体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A.对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%.利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A分别进行表达.结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白.证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达.     

专题询问:如何从根子上解决“屡改屡犯”

专题询问会上,大家认真对待,有来有往,问出实效,答出担当。栗战书委员长在讲话中指出,要对标对表党中央决策部署,思想上高度重视,把查问题和改问题、治已病和防未病有机结合起来,从根子上解决"屡改屡犯"问题。     

稳定表达马红球菌VapA蛋白细胞系的建立及其对巨噬细胞自噬的影响

通过构建稳定表达VapA蛋白的J774A.1巨噬细胞系,探究马红球菌VapA蛋白对巨噬细胞自噬的影响.构建vapA基因的重组慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-vapA,将其转染J774A.1细胞,经过嘌呤霉素筛选重组细胞,利用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光鉴定重组细胞系中VapA蛋...     

法制课堂进地头

4月27日,在农二师三十三团十九连20—1条田地头上,100多名职工听到了一场别开生面的法制教育课。虽然正值团场晚春播的大忙季节,三十三团工会并没有放松对职工的法制和安全教育。结合生产实际,该团十九连因时、因地制宜,开     

论合作作品的立法模式兼论我国《著作权法》第13条的修订

合作作品的立法模式有三种,分别是狭义说、广义说和折中说.我国现行著作权法采取的是广义说,并没有清楚阐述合作作品的内涵和外延,也没有厘清合作作品的构成要件,其并没能够圆满实现合作作品制度解决权利归属和利益分享的立法宗旨.鉴于此,在未来《著作权法》的修订过程中,我们应当细化作品的类型,既规定合作作品,又规定结合作品；应当明确合作作品的构成要件.同理,我们也应当把属性不同的集体作品从普通的汇编作品中分离出来,单独做出规定.     

从“五个结合”入手探索改制企业党建之路

华烁科技股份有限公司前身为湖北省化学研究院，成立于1973年，隶属于湖北省科技厅。2008年经湖北省人民政府批准，由湖北省化学研究院整体改制成为非国有控股，混合所有制的高科技股份公司。几年来，在新的体制、新的机制条件下，公司党委始终坚持以中国特色社会主义理论体系为指导，以科学发展观为统领，解放思想，勇于实践，从“五个结合”入手，对非公有经济党建进行了一些有益的探索。