用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

聚合酶链反应在猪伪狂犬病临床诊断中的应用

应用ＰＣＲ技术对２４个猪场送检的３１４头新生仔猪和断奶仔猪病料进行伪狂犬病病毒ＤＮＡ片段检测，检出阳性猪场２１个，占受检猪场的８８．０％；检出阳性病料１５２头份，阳性率为４８．４％。另对怀疑为伪狂犬病的１５９头猪鼻拭子样品进行检测，检出阳性猪１２０头，阳性率达７５．０％。     

猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖基因的原核表达及其产物的细胞毒性

参考GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清2型荚膜多糖基因的序列分别设计了3对特异性引物,通过PCR分别扩增了CpsA、CpsB、CpsC 3个基因,获得长约1 137、429、1 146 bp的片段,将其分别克隆到pMD 18-T中,经酶切鉴定和序列分析获得了阳性克隆子;再将CpsA、CpsB、CpsC分别插入原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21,在IPTG诱导下获得高效表达,经Western-blotting检测证实,表达产物CpsC有生物学活性,CpsA、CpsB无活性;将3种表达产物等量混合,做10倍递进稀释后,与分离出的猪嗜中性粒细胞作用,37℃5、0 mL/L CO2培养箱中温育4 h后加入底物液,测定D492 nm值。结果表明,App荚膜多糖对猪嗜中性粒细胞无毒性作用。