巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究

为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素(PMT)对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N(1~1461 bp)和C端tox C(2 958~3 858 bp)分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式表达,其分子质量大小分别为176 ku、88 ku和67 ku,均能与His单克隆抗体发生特异性免疫反应。体外细胞毒性试验和豚鼠皮肤坏死试验均表明,r PMT与天然PMT具有相同的生物学功能。此外,以原核表达蛋白r PMT-N和r PMT-C分别制备的鼠多抗为一抗,对转染表达N端和C端真核质粒的Vero细胞进行IFA和Western-blot检测。结果表明,2种蛋白特异性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究的成功开展将为后续探究PMT细胞内作用机制提供可靠的生物材料。