旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。     

旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因TsCystatin1的克隆及序列分析

为了研究旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的功能,应用电子克隆的方法从GenBank EST数据库获得1个旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(TsCystatin1)的部分cDNA序列,据此设计引物,并以旋毛虫新生幼虫总RNA为模板,进行反转录及PCR,克隆到该基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对其进行了预测分析。结果表明,TsCystatin1 cDNA序列含有一个由666个核苷酸组成的开放阅读框架,编码由221个氨基酸残基组成的多肽,蛋白分子质量理论值为24.3ku,理论等电点为4.44。TsCystatin1第1～25位氨基酸残基为信号肽序列,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的保守序列QVVAG,其C末端具有3处N-糖基化位点以及4个链内二硫键所需的半胱氨酸残基。该蛋白的二级结构中α螺旋占18.6%,β折叠占23.5%,其余57.9%为转角。结构域分析表明,该蛋白具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,与其他线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的同源性较高。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

旋毛虫TsP53重组蛋白对小鼠的免疫保护性

将旋毛虫TsP53重组蛋白以20μg/只的剂量免疫小鼠3次后攻击感染旋毛虫肌幼虫200条/只。检查小鼠肠道旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数和感染35d后的肌幼虫数,并计算减虫率,同时用间接ELISA检测血清中抗TsP53重组蛋白的抗体应答。结果显示,TsP53重组蛋白免疫小鼠旋毛虫7日龄成虫、雌虫产新生幼虫的减虫率分别为14.34%和16.93%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异不显著(P0.05);感染35d后肌幼虫减虫率为38.68%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异显著(P0.05)。TsP53重组蛋白免疫小鼠在首次免疫后第7天出现抗体应答,可检测到抗TsP53重组蛋白的抗体,第3次免疫后第7天达到峰值,攻击感染后略有下降,但直到试验结束时仍然维持在较高水平,TsP53重组蛋白可诱导小鼠产生部分抗旋毛虫的免疫保护性。