用间接ELISA检测鸡血清中传染性鼻炎抗体

用间接ＥＬＩＳＡ检测鸡血清中传染性鼻炎抗体陈小玲，陈葵，张培君，龚玉梅（北京市农林科学院畜牧兽医研究所１０００８１）鸡传染性鼻炎（ＩＣ）是由副鸡嗜血杆菌（Ｈｐｇ）引起的鸡上呼吸道传染病。国内外用于诊断和检测免疫水平的血清学方法主要有玻板凝集试验（ＡＧ...     

分泌抗副鸡嗜血杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

分泌抗副鸡嗜血杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立１）张培君佟瑞平陈小玲（北京市农林科学院畜牧兽医研究所１０００８１）Ｐ．Ｊ．Ｂｌａｃｋａｌ（澳大利亚昆士兰州动物研究所）副鸡嗜血杆菌（Ｈｐｇ）是引起鸡传染性鼻炎（ＩＣ）的病原菌。根据Ｐａｇｅ的分型方法，Ｈ...     

猪圆环病毒2型ORF2基因的优化表达及活性检测

通过软件分析后,截去猪圆环病毒2型ORF2基因中影响蛋白表达的保守基因,并对其余的基因进行了密码子优化。把改造后的ORF2基因连接到pGEX-4T-1载体上并转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出分子质量为50ku的重组蛋白,在0.2mmol/L的IPTG诱导5h情况下表达效果最好,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经琼脂糖凝胶纯化可得到较纯的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能刺激小鼠产生相应抗体,并能与PCV2阳性血清进行特异性免疫印迹反应。试验结果证实表达的蛋白具有良好的抗原性。     

MEM对副鸡嗜血杆菌的增菌作用

鸡传染性鼻炎(IC),是由副鸡嗜血杆菌(Haemophius paragallinarum,简称Hpg)引起的一种呼吸道传染病。该病主要影响母鸡产蛋、小鸡生长发育和肉鸡的肉质。为防制本病,我们正在进行IC灭活苗的研制。在培养Hpg时,使用了鸡血清鸡肉汤培养基和半合成培养基,结果发现,这两种培养基长菌数量均有限。为便于工厂化生产和降低培养基成本,笔者于半合成培养基中加入不同浓度的Eagle氏最低要素营养液(MEM),作增菌试验,取得较好效果。     

副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选

为了筛选副鸡嗜血杆菌的体内表达基因,提取了副鸡嗜血杆菌的全基因组,构建了副鸡嗜血杆菌基因组的pET系统表达文库。运用PCR及核酸内切酶(SalⅠ+NdeⅠ)鉴定基因文库,并以病原菌吸附后的康复血清作为探针,采用菌落原位杂交的方法对基因文库进行筛选。结果显示,重组质粒中有0.5～2kb的片段插入,99%的基因包含在基因文库中;重复筛选后得到的阳性克隆再经过PCR与SalⅠ+NdeⅠ酶切鉴定后定向测序,并对测序结果在NCBI上进行分析后发现筛选获得的基因中,有1个表达为转运谷氨酰还原酶、1个表达为转录终止因子,1个表达为荚膜合成域2,还有2个表达为保守假想蛋白。结果表明,本研究应用体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选到了一些副鸡嗜血杆菌体内诱导表达基因,并对基因的功能做了初步探讨,在找寻副鸡嗜血杆菌在体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为传染性鼻炎的预防和治疗积累了有价值的资料。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a( )载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。     

巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病防制中应用的研究进展

从表达载体、宿主细胞、培养条件3个方面概述了巴斯德毕赤酵母表达系统的特点,综述了其在抗菌肽生产、动物疫苗生产以及动物疾病诊断试剂盒研制中应用的最新进展,展望了巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病研究中的应用前景.     

副鸡禽杆菌的指纹图谱分型

为了探索副鸡禽杆菌的新型分型方法,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)和随机核苷酸多态性片段(RAPD)为靶序列进行PCR扩增,对所得指纹图谱用POPGENE和MEGA4.0软件进行遗传距离的计算和聚类分析。结果显示,2种方法均能得到丰富﹑稳定的指纹图谱,其多态性为85.7%(18/21);10个国际标准株、血清C型疫苗株以及4个国内分离株可分为11个谱型,聚为4类。划分的11个谱型可以和现有分型方法中的不同亚型一一对应,提示这种方法可以区分不同血清亚型。表明指纹图谱技术可以有效地区分不同菌株,从而为分子流行病学调查和疫苗研制提供了参考。     

副鸡禽杆菌抗原表位的筛选与鉴定

用C型副鸡禽杆菌(Apg)单克隆抗体作为靶标,筛选噬菌体展示随机12肽库,从中获得与之特异性结合的噬菌体克隆,建立了一种筛选副鸡禽杆菌表位的方法.测序结果显示,第3轮筛选后,80%的噬菌体克隆具有氨基酸共同序列Y-P-Q(A)WW,舍有上述共有序列的噬菌体克隆不仅可以与靶抗体特异结合,还可与C型Apg细菌竞争结合靶抗体;将编码YSPHQWWLSGAV的DNA片段插入质粒pFliTrx的多克隆位点,转化E.coli G1826并在鞭毛成功展示;该重组菌能与靶抗体特异结合;用重组菌免疫试验鸡能产生C型Apg细菌的特异性抗体;用C型668株Apg攻毒,免疫接种鸡获得37.5%保护.提示该表位肽用于研制鸡传染性鼻炎疫苗具有广阔的应用前景.