用RAPD技术分析鸡毒霉形体广西分离株的DNA多态性的研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物成对组合的方式对鸡毒霉形体(MG) 5株广西分离株和 3株标准株DNA进行了多态性分析。结果显示 ,所选用的 2 0条引物中 ,有 3对 (6条 )引物扩增的条带为 2～ 10条 ,大小在 2 0 0～ 30 0 0bp。相似指数分析显示 ,广西MG分离株Y2与WL、CH与Y3的相似指数最高 ,分别为 0 .92和 0 .86 ,其与H2的相似指数为 0 .36～ 0 .6 2。 3株MG标准毒株S6、K2 2 2 1、K15 0 1与广西分离株间的相似指数为 0 .17～ 0 .5 7。表明广西流行的MG与MG标准株存在差异 ,当地的流行株也呈现多样性     

PRV和CAstV-Ⅰ及CIAV纳米PCR检测方法与常规PCR检测方法敏感度的比较

为了比较PRV、CAstV-Ⅰ和CIAV的单重纳米PCR方法和单重PCR方法的敏感性,探讨靶基因GC含量和引物Tm值对纳米PCR和常规PCR的影响,本研究根据PRV的gE基因、CIAV的VP1基因和CAstV-Ⅰ的ORF1b基因设计了12对引物,运用这12对引物建立单重的纳米PCR方法和常规PCR方法,分别优化纳米PC...     

广西鸡毒霉形体的分离与鉴定

从广西不同地区采集疑似鸡毒霉形体 (MG)感染的 46份病鸡病料中分离到 7个菌株 ,经分离培养、L形细菌检验、理化特性鉴定、血清学定型、人工感染试验以及PCR扩增检测等方法鉴定 ,确定 7个分离株为MG。     

用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白

应用SDS PAGE对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisepticum ,MG) 4个标准株和 5个广西分离株的结构蛋白进行了比较分析。结果 ,在凝胶电泳图谱中 10～ 10 0ku蛋白分子质量之间 ,F株缺少 87ku蛋白带 ,Y3株在最靠近 87ku蛋白带的上方和下方各缺少 1条蛋白带 ,H2株和Y2株缺少 6 4ku蛋白带 ,CH株缺少 2 9ku蛋白带 ,97、75、4 3ku处的蛋白带为 4个MG标准株和 5个MG分离株所共有。表明 9个MG供试菌株的结构蛋白都存在一定的差异 ,广西MG分离株的结构蛋白呈现多样性。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

应用多重聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

根据鸡毒霉形体（ ＭＧ） 、滑液霉形体（ ＭＳ） 的基因文库,设计并合成了分别与ＭＧ、ＭＳ 某段基因序列互补的两对引物,用这两对引物进行多重聚合酶链反应（ ＭｕｌｔｉＰＣＲ） 同时检测ＭＧ 与ＭＳ。当样品中同时含有ＭＧ 和 ＭＳ 的目的模板ＤＮＡ 时,均同时得到２ 条大小与试验设计相符的７３２ ｂｐ（ ＭＧ） 和２０７ ｂｐ （ ＭＳ） 的ＰＣＲ 扩增带;而对其它８ 种禽病病原的扩增均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ 技术最低能同时检出１００ ｆｇ 的ＭＧ、ＭＳ ＤＮＡ 模板量     

鸡细小病毒荧光LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种可鉴别鸡细小病毒(ChPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据鸡细小病毒NS1基因的保守序列,设计了1套特异性引物,在该套引物的F3与B3区域中设计1个探针,其探针用FAM标记,优化建立了能鉴别ChPV的荧光LAMP检测方法,并使用所建立的方法对21份临床样品进行检测。结果显示,该方法特异性好,能检测到ChPV,并与其他禽类病毒无交叉反应;灵敏度高,最低能够检测1.02×10^-5ng/μL的ChPV DNA模板;对临床可疑样品的检出率为24%。表明,本研究建立的ChPV荧光LAMP方法具有简便快速、特异性好、敏感性高等优点,可用于检测ChPV。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。