青海血蜱成蜱cDNA表达文库的免疫学筛选及阳性克隆分析

采用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清,对青海血蜱成蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选,并对获得的阳性克隆进行序列测定及同源性分析.结果显示,共获得9个新cDNA序列,其中3个新基因序列已被GenBank接受,并获得序列接受号.表明,从青海血蜱成蜱cDNA表达文库筛选到一批新基因,为青海血蜱保护性抗原的筛选奠定了基础.     

日本血吸虫Sj314C10基因的获得及其DNA疫苗的构建

利用快速cDNA末端扩增(RACE)技术结合“电子cDNA文库”筛选法,对日本血吸虫成虫期特异表达基因EST片段的全长序列进行了扩增,获得了一含完整开放性阅读框(ORF)的基因序列(GenBank中的登录号为AY847290)。经对该基因序列进行分析,表明其为日本血吸虫的一新基因,命名为Sj314C10。将该基因的蛋白编码区克隆到真核表达载体pcDNA3 中,把构建好的重组质粒转化到大肠埃希氏菌DH5α中培养;筛选阳性克隆进行序列鉴定,经分析表明与预期的结果一致。成功地构建了该基因的DNA疫苗,为该基因作为疫苗候选分子的研究奠定了基础。     

感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞酵母双杂交文库的构建

为研究环形泰勒虫裂殖体与牛淋巴细胞之间的相互作用,以感染了环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞系为材料,构建了感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞系的酵母双杂交cDNA文库。首先,提取纯化细胞系的mRNA,经反转录合成第一条链cDNA,通过LD-PCR合成双链cDNA。柱层析剔除250bp以下的小片段;将双链cDNA与经SmaⅠ处理过的文库质粒pGADT7-Rec一起转入到酵母Y187感受态细胞内,双链cDNA与文库质粒会发生同源重组,经过抗性筛选即可得到酵母双杂交cDNA文库。文库构建结果显示,该文库库容量达2.4×107 CFU,插入片段的平均长度在1 000bp左右,达到试剂盒建库要求。     

泛亚型口蹄疫病毒O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建

设计并合成了4条O型口蹄疫病毒(FMDV)泛亚型代表毒株O/China/99基因组的引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连接到pOK12载体上,然后人工合成一段缺失PKs的5′UTR序列,利用两端的限制性内切酶位点,将该基因片段插入到上述载体中。酶切、PCR和序列测定结果显示,O/China/99株全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的核苷酸序列同源性为99.1%。结果表明,O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建成功。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV-SC株基因组cDNA文库的构建及生物信息学分析

根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR技术从山羊地方性鼻内肿瘤自然感染病例的鼻液中分段扩增获得了ENTV的基因组,构建了ENTV的cDNA文库,并对基因组序列进行了生物信息学分析.结果显示,获得的序列全长7 168 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及部...     

D28k钙结合蛋白cDNA的克隆及序列分析

利用RT PCR技术从鸡小肠组织RNA中扩增鸡D2 8k钙结合蛋白cDNA ,以进一步研究D2 8k钙结合蛋白促进肠钙吸收的机理。结果表明 ,鸡肠道D2 8k钙结合蛋白cDNA的开放阅读框由 789个碱基对组成 ,编码由 2 6 2个氨基酸组成的多肽 ,分子质量约为 2 7.9ku ;禽类D2 8k钙结合蛋白基因长 18.5kb ,10个间插序列将其分成 11个编码外显子 ,启动子区以GC为主 (6 0 %～80 % )。D2 8k钙结合蛋白氨基酸序列的同源性在鼠和人之间达到 98.5 % ,在蟾蜍和鸡之间达到80 .9% ,在人和鸡之间为 79.8% ,在鼠和鸡之间为 79.5 %。不同种属的动物之间D2 8k钙结合蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性。     

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo( )和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo( )载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)携带了FMDVOH/99基因组全长cDNA序列     

青海血蜱幼蜱cDNA表达文库的构建及其保护性抗原基因的免疫学筛选

采用常规方法构建了青海血蜱幼蜱cDNA表达文库,初级文库的库容量为5.0×105PFU/mL,扩增后的库容量为8×109PFU/mL;用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清对该文库进行了免疫学筛选,对阳性噬菌体进行了亚克隆,提取质粒后转化宿主菌JM109,最终共得到幼蜱基因11个,分别命名为HqL1、HqL2、HqL3、HqL4、HqL5、HqL6、HqL7、HqL8、HqL9、HqL10、HqL11。测序分析表明,其中的6个为新基因。分析发现HqL7、HqL8、HqL9和HqL11具有较高的研究价值。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.