鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析

通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF.采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamH Ⅰ Hind Ⅲ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性.结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白.DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近.     

皮肤烧伤愈合过程中磷酸化c-Jun的表达

目的观察烧伤后人皮肤磷酸化c-Jun(p-c-Jun)的变化特点,初步探讨烧伤后创面愈合的分子机制。方法取12例烧伤后住院植皮患者的烧伤周边区皮肤为实验组;另取正常皮肤12例为对照组。应用免疫组织化学方法和常规HE染色检测p-c-Jun在皮肤烧伤周边区和正常皮肤组织中的变化情况。结果对照组p-c-Jun阳性颗粒主要定位于表皮细胞和内皮细胞中,阳性细胞率为(13.9±2.7)%;实验组p-c-Jun阳性颗粒主要定位于表皮细胞和部分炎细胞中,阳性细胞率上升至(47.2±8.6)%,明显高于对照组(P0.01)。结论烧伤后人皮肤p-c-Jun的表达可能与创面愈合有关。     

乌头碱对培养新生大鼠心室肌细胞Connexin43蛋白磷酸化的影响

目的建立细胞水平的染毒模型,观察乌头碱对心肌细胞缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的影响。方法实验分0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0μmol/L等6个不同浓度乌头碱染毒组,运用蛋白印迹法和免疫荧光技术,检测各组及对照组心肌细胞Cx43蛋白磷酸化状态的改变。结果蛋白印迹检测显示,不同浓度染毒组心肌细胞中Cx43蛋白总量与正常对照组无显著差异;0.5μmol/L乌头碱染毒后,Cx43开始出现脱磷酸化;当染毒浓度达到1.0μmol/L后,Cx43脱磷酸化显著,且1.5及2.0μmol/L染毒效果和1.0μmol/L染毒组相当。免疫荧光分析结果提示乌头碱作用后,心肌细胞Cx43蛋白在羧基端第368位点丝氨酸残基(Ser368)发生明显的脱磷酸化。结论一定浓度的乌头碱能诱导心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43发生显著脱磷酸化。     

小鼠皮肤损伤愈合过程中PI3K/Akt通路的作用

目的探讨小鼠皮肤损伤愈合过程中损伤区磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phospho-PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)和磷酸化蛋白激酶B(phospho-Akt,p-Akt)的表达及其随时间的变化规律。方法应用免疫组织化学染色、Western印迹法和real-time PCR技术检测小鼠皮肤损伤不同时间段PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的变化情况。结果免疫组织化学染色显示,皮肤损伤后,PI3K、p-Akt阳性染色出现在单核细胞和成纤维细胞,峰值出现在组织修复期。Western印迹法显示,各个时间段均有PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的阳性条带,其中p-PI3K、p-Akt表达的峰值出现在炎症期和增生期,PI3K、Akt表达的高峰出现在组织重建期。real-time PCR结果显示,PI3K m RNA的峰值出现在炎症期和组织重建期,Akt m RNA的峰值出现在组织重建期。结论在皮肤损伤愈合过程中,PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的表达变化呈现不同的规律性并有较好的时间依赖性,PI3K/Akt通路的表达规律可以用于法医学损伤时间推断。     

小鼠皮肤切创黏着斑激酶和磷酸化黏着斑激酶的表达及其变化规律

目的研究小鼠皮肤切创愈合过程中,黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和磷酸化黏着斑激酶（phospho—FAK,p—FAK）在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律。方法应用免疫组织化学染色技术和免疫印迹（Western blot）方法观察小鼠背部切创后损伤区及损伤周边区FAK及p-FAK的表达情况。结果伤后3h,FAK和p-FAK主要表达于多核粒细胞;伤后6～24h,主要表达于大部分浸润的多核粒细胞和单核细胞;伤后3～14d。主要表达于单核细胞和成纤维细胞。伤后FAK的阳性细胞率逐渐增高．于3d达到高峰．随后迅速下降;伤后p-FAK的阳性细胞率也逐渐增加,于12h达到高峰,之后逐渐下降。Westernblot结果显示,正常皮肤中FAK及P—FAK均有表达。FAK表达强度变化不是十分明显,但仍可见在3d时含量达到最高。p-FAK蛋白含量伤后逐渐增加．12h表达最强,随后逐渐下降。结论在小鼠皮肤切创愈合过程中,FAK和p-FAK阳性细胞率呈时间规律性变化．可用于皮肤切创损伤时间的推断。p-FAK呈现出明显的时间规律性变化,说明作为皮肤损伤时间的推断指标要优于FAK。     

平喘宁调节ERK信号通路干预哮喘气道重塑的机制

目的 通过观察平喘宁干预后哮喘模型大鼠ERK信号转导通路相关蛋白以及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）的表达,探讨平喘宁调节寒性哮喘大鼠气道重塑的机制。方法 采用SPF级雄性SD大鼠复制寒性哮喘模型。将大鼠随机分成正常对照组,模型组,地塞米松组,桂龙咳喘宁组以及平喘宁高、中、低剂量组。连续给药4周后,光镜下观察肺组织病理形态学变化,采用免疫组织化学法检测肺组织中TIMP-1、MMP-9表达水平;采用Western blot法检测大鼠肺组织血小板源性生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）、细胞外信号调节激酶-1（extracellular signal-regulated kinase 1,ERK1）、磷酸化细胞外信号调节激酶-1（phosphorylated ERK1, p-ERK1）的表达水平。结果 与正常对照组比较,模型组有明显炎性细胞浸润、气管上皮脱落增多、气管平滑肌增厚等气道重塑现象;与模型组比较,各治疗组炎性细胞浸润减少,气管上皮脱落减少,平滑肌增厚情况改善,气道重塑均得到适当缓解。与正常对照组比较,模型组MMP-9、TIMP-1的表达水平显著升高（P<0.05）;而与模型组比较,平喘宁各剂量组MMP-9、TIMP-1表达水平均显著下降（P<0.05）,尤其是平喘宁高剂量组下降最为明显。与正常对照组比较,模型组PDGF以及ERK1、p-ERK1蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;而与模型组比较,药物治疗组PDGF以及ERK1、p-ERK1蛋白的表达水平均显著下降（P<0.05）。结论 平喘宁可通过调节ERK信号通路减轻哮喘大鼠气道炎性反应,延缓气道重塑。     

电针夹脊穴通过磷酸化p38 MAPK信号通路对大鼠炎性痛阈的影响

目的 观察电针夹脊穴对炎性疼痛大鼠痛阈的影响,从信号转导的角度探讨针灸镇痛的机制. 方法 采用经典的完全弗氏佐剂性关节炎疼痛模型,观测电针刺激对大鼠痛阈的影响,采用免疫组织化学法测定各组大鼠背根神经节(doral root ganglion, DRG)内磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylation-p38 mitogen activated protein kinase, p-p38 MAPK)的含量,采用蛋白印迹法测定DRG内辣椒素受体1(vanilloid receptor 1, VR1)含量. 结果 电针刺激影响大鼠DRG内p-p38 MAPK和VR1含量,并可提高炎性疼痛大鼠的痛阈,降低p38 MAPK受体阻断剂提高后大鼠的痛阈. 结论 电针影响炎性疼痛的机制与p38 MAPK-VR1信号通路密切相关.