H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

禽流感二价抗原油乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒(AIV)H5N4株、H7N3株为抗原研制了H5N4-H7N3二价油乳剂灭活疫苗,并对其物理性状、安全性、免疫效力、保存期及抗体消长规律进行了检测.结果表明,试验鸡疫苗在免疫后3周到9个月内对AIV-H5N4的攻击均获全部保护.疫苗4℃保存15个月,其免疫效力没有下降.     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

用醛化红细胞分离抗禽流感病毒独特型多克隆抗体

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)抗体免疫家兔,制备抗独特型多克隆抗体;用戊二醛醛化的红细胞固定非特异性鸡抗体,再吸附兔抗鸡抗体,获得了纯的抗独特型抗体。经鉴定,该抗体既有弱的血凝性又有弱的血凝抑制性,并能与原病毒竞争性地和鸡抗AIV抗体结合。