米尔贝肟对犬钩虫的体外作用

为了评价犬钩虫对米尔贝肟的体外敏感性,试验设空白对照组,米尔贝肟高、中、低剂量组及伊维菌素对照组,考察了药物对犬钩蚴三期幼虫形态和活力的影响及对其移行能力的影响。结果显示,未添加药物的钩蚴大部分保持笔直,而几乎没有弯曲或者卷曲,而在药物添加组,部分钩蚴出现大于45°角的弯曲,弯曲程度远远大于未添加药物的正常虫体;米尔贝肟用药量在1×10-5 g/mL时,8h杀虫率达100%,米尔贝肟用药量为1×10-6 g/mL时杀灭犬钩虫幼虫的显效时间及杀虫效果与伊维菌素组差异不显著(P>0.05);米尔贝肟和伊维菌素对犬钩蚴的移行有显著的抑制作用。结果表明,犬钩虫对米尔贝肟在体外具有一定的敏感性。     

牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验.结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×10~5 copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性.表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测.     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查

为了调查我国牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,应用新孢子虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和弓形虫间接血凝试验(IAT)分别检测了来自国内10个省(市、自治区)的262份乳牛、10份肉牛和40份水牛血清。结果显示,乳牛新孢子虫的抗体阳性率为17.2%,弓形虫的抗体阳性率为2.3%,没有检测到既有新孢子虫抗体又有弓形虫抗体的乳牛血清。各牛场所检乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率在0~34.4%之间。在水牛和肉牛血清中未检测到新孢子虫抗体和弓形虫抗体。流产乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率为20.2%,未流产乳牛为16.1%,其中血清抗体阳性乳牛主要在妊娠中晚期流产。各个年龄段乳牛血清的抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。不同妊娠胎次的乳牛血清抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。确认新孢子虫病在国内大部分牛场存在。     

乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定

在血清学调查的基础上,进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定。取新孢子虫血清抗体阳性乳牛的流产胎牛的脑、心、肺、脾、肝等组织进行病理学检查,经HE染色观察到脑组织中存在类似于新孢子虫包囊样结构,经免疫组织化学染色排除刚地弓形虫包囊的存在,确认该包囊为新孢子虫包囊。同时提取流产胎牛脑组织DNA,应用新孢子虫特异性引物Np6/Np21进行PCR扩增,扩增出的特异性目的条带的序列与新孢子虫标准株Nc-1的gene 5序列的一致性为98%。首次证实我国大陆流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。