江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法,对2005~2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果,PRRSV阳性率为51.2%,PCV2阳性率为44.1%,CSFV阳性率为10.4%,PPV阳性率为3.9%,PRV阳性率为2.4%。2005年病料中PCV2阳性率为21.2%,2006年为73.2%;2005年PRRSV阳性率为38.1%,2006年为67.7%。2006年猪高热病疫情比2005年严重,PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明,2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

猪生殖与呼吸综合征病毒广东株ORF3和ORF5基因的克隆与分析

采用RT PCR方法扩增了猪生殖与呼吸综合征病毒广东株的糖蛋白基因ORF3、ORF5 ,并对其进行了克隆和序列分析。用Blast分析软件比较分析了其与VR 2 332株以及流行的欧洲株之间的同源性 ,并对其编码氨基酸序列的分子质量、等电点、穿膜区、糖基化位点进行了分析。结果显示 ,PRRSV广东株ORF3与美洲株的同源性达 90 % ,而与欧洲株只是在 318～ 393bp、5 0 2～ 6 97bp之间有 77%左右的同源性 ;ORF5与美洲株的同源性为 88% ,与欧洲株仅在 133～ 2 0 9bp区间有 77%左右的同源性。     

猪圆环病毒2型ORF2与EGFP融合蛋白表达载体的构建及在鸭心肌细胞中的表达

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在异源细胞上的表达及生物学特性,构建了PCV2ORF2与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-N1-ORF2。采用脂质体法转染体外培养的鸭心肌细胞后,通过直接荧光观察EGFP-ORF2融合蛋白在鸭心肌细胞中的分布定位,经RT-PCR、间接免疫荧光方法检测ORF2基因在鸭心肌细胞中的表达。结果显示,转染48 h后有绿色荧光出现,RT-PCR和间接免疫荧光法检测均为阳性。证实,PCV2 ORF2基因在鸭心肌细胞内获得了成功表达。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。