不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP M 199(TM ,1∶2 )、BMOC M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的比较

目的:比较脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的差异。方法:分别采用脑络欣通药物血清和胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果:脑络欣通药物血清和胎牛血清均可诱导绝大多数神经干细胞分化成神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,脑络欣通药物血清还能在一定程度上促进培养的神经干细胞的增殖。前者诱导干细胞分化的进程比后者要慢,但其分化的神经细胞在细胞形态学上与发育成熟的神经细胞更为接近。结论:脑络欣通药物血清能够诱导神经干细胞分化,并使其分化更加成熟,且在一定程度上促进培养的神经干细胞的增殖。     

含硒型牛副伤寒活疫苗免疫持续期的试验

用 2批含硒型牛副伤寒活疫苗 (2 0 0 10 1,2 0 0 2 0 1)分别免疫牦牛 ,在免疫后第 7、30、6 0和90d采血 ,进行了血硒含量及血清抗体的检测。结果显示 ,这 2批疫苗免疫牦牛后 ,血硒浓度在0 .0 5 μg/mL以上可维持 90d ,第 7d可产生坚强的免疫应答。在免疫后 6个月和 13个月攻毒 ,均产生 10 0 %的保护。试验表明 ,含硒型牛副伤寒活疫苗对牦牛的免疫保护持续期至少为 12个月。     

丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养牛肝细胞内丙酮酸羟化酶基因mRNA水平的影响

在成功构建牛肝细胞培养模型和PC基因DNA竞争模板的基础上,采用竞争RT-PCR方法检测了丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养新生牛单层肝细胞PC基因mRNA丰度的影响。结果,随着丙酸钠浓度的升高,PC基因mRNA水平呈上升趋势,PC基因mRNA对丙酸钠的耐受范围较广;随着丙酮酸钠浓度的升高PC基因mRNA水平呈先上升后下降的趋势。结果表明,肝细胞内PC基因mRNA的表达水平受丙酮酸钠浓度的调控,在一定范围内丙酮酸钠对PC基因mRNA的转录具有促进作用,而浓度过高时则起抑制作用。     

Developmental validation of feline, bovine, equine, and cervid quantitative PCR assays

Accurate DNA quantification is essential for optimizing DNA testing and minimizing sample consumption. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays have been published for human and canine nuclear DNA, and the need for quantifying other forensically important species was evident. Following the strategy employed for the canine qPCR assay, we developed individual assays to accurately quantify feline, bovine, equine, and cervid nuclear DNA. Each TaqMan-based assay incorporates a genus-specific probe targeting the Melanocortin-1 Receptor gene and includes a piece of synthetic DNA that acts as an internal PCR control for detecting inhibition. Developmental validations were carried out following the revised guidelines of the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods with modifications necessary for validation of nonhuman qPCR assays. All assays demonstrated the specificity, sensitivity, stability, reproducibility, accuracy, and precision required for forensic casework. The application of these assays to animal forensic DNA analysis has both conserved laboratory resources and improved genotyping results.     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

牛结节性皮肤病防控技术研究现状及其策略

2019年8月我国新疆伊犁地区首次爆发牛结节性皮肤病,为做好该病的防控工作,防止外来疫情扩散蔓延到我国内地,现将该病防控的诊断检测技术、疫苗研发状况以及我国的策略进行概括介绍,为有效控制、净化和根除该病提供指导。     

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系(MDBK)培养牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该ELISA的判定标准为:血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好。与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%。     

猪胚胎多能性干细胞的分离培养

收集妊娠 2 6 .0～ 2 9.0d的猪胚胎 ,分离培养原始生殖细胞 (PGCs) ,在STO细胞饲养层上生长 ,形成了多能性干细胞 (EG)。发现其具有干细胞的显著特性 ,并能在体外定向分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。试验使用A、B、C 3种不同的培养基培养PGCs ,结果在形成EG细胞集落的数量和EG细胞分化上有着明显的差距 ,说明血清的质量和浓度以及细胞因子对干细胞的生成和增殖有着重要的影响