中华鳖全血呼吸爆发化学发光检测方法的建立

为进一步研究中华鳖的先天免疫能力及其机理,以酵母多糖为吞噬底物,通过对鲁米诺浓度、全血稀释度和检测温度等条件的优化,建立了中华鳖全血呼吸爆发的化学发光检测方法,并用此方法对放置不同时间的全血和稀释血液进行了呼吸爆发检测效果的比较。结果表明,鲁米诺浓度为1×10-4mol/L,检测温度为31.5℃时,以0.4~0.8μL/mL的中华鳖全血进行检测可获得理想效果。保存6 d的全血仍可检测到呼吸爆发,稀释全血放置30 h后不再产生呼吸爆发。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法,对2005~2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果,PRRSV阳性率为51.2%,PCV2阳性率为44.1%,CSFV阳性率为10.4%,PPV阳性率为3.9%,PRV阳性率为2.4%。2005年病料中PCV2阳性率为21.2%,2006年为73.2%;2005年PRRSV阳性率为38.1%,2006年为67.7%。2006年猪高热病疫情比2005年严重,PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明,2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。     

冠状病毒感染性疾病尸体检验相关病原学检测回顾与展望

冠状病毒曾经给世界带来两次严重的人类间大流行,包括严重急性呼吸综合征(severe acute re?spiratory syndrome,SARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS),2019年岁末新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2...     

猪生殖与呼吸综合征血清抗体重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组N蛋白作为包被抗原 ,通过对各项试验条件的优化 ,建立起检测PRRS血清抗体的重组N蛋白间接ELISA检测方法。用此方法检测了2 0 0份血清样品 ,并与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测结果相比较 ,敏感性和特异性分别为 93%和95 % ,总符合率达 91%。 2种检测方法的结果之间差异不显著 (P >0 .0 5 )。试验表明 ,建立的间接ELISA检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点 ,可用于PRRS血清抗体的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

Use of an Automated Nested Multiplex Respiratory Pathogen PCR Panel Postmortem in the Pediatric Forensic Setting

Respiratory pathogens have been detected in forensic investigations using multiple techniques; however, no study has examined the use of automated, nested, multiplex polymerase chain reaction (ANM‐PCR), commonly used in living patients, in the forensic setting. This retrospective study assessed the utility of ANM‐PCR in detecting respiratory pathogens in the pediatric forensic setting. Respiratory samples from 35 cases were tested for up to 20 respiratory pathogens. 51.4% of these cases yielded a positive ANM‐PCR result, 20% of which were considered the cause of or contributory to death. The most commonly detected pathogens were rhinovirus/enterovirus and respiratory syncytial virus, and these were the only pathogens determined to play a significant role in cause of death. The sampled sites and postmortem intervals tested did not affect the likelihood of a positive or negative test. ANM‐PCR panels are effective, affordable, and rapid ancillary tools in evaluating cause of death in the forensic pediatric population.