堆型艾美球虫广东株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫31E基因序列,设计了3条引物,以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板,利用反转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增获得了31E基因部分片段,将这一片段克隆至pGEMTEasy载体中,经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较,证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现,所克隆的基因片段与Eimeriaacervulina美国株(US)、E.acervulinaQH株31EcDNA的核苷酸同源性分别为99.0%和99.2%,推导氨基酸的同源性分别为98.2%和97.6%。     

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针,建立了快速检测沙门茵的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测,该试剂盒的检测灵敏度达4．5 CFU(25μL反应体系),比常规PCR高100倍,而且稳定性良好,至少可以冷冻保存9个月。结果表明,所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,适于大量样品的检测。     

鸡白细胞介素-2受体基因γ链的转录分析与表达

以脾单个核细胞总RNA为模板,对鸡白细胞介素-2受体基因γ链(chIL-2Rγ)进行了RT-PCR,获得了一1 047 bp的开放阅读框,编码由348个氨基酸残基组成的分子质量为37.8 ku的蛋白多肽。预测的鸡IL-2Rγ多肽链中包含4个保守半胱氨酸残基、1个WSXWS基序和7个N连接的糖基化位点。鸡IL-2Rγ与其他动物IL-2Rγ在氨基酸水平上的同源性仅为21.4%~38.2%。RT-PCR检测发现,鸡IL-2RγmRNA分布于大脑、小脑、脊髓、腔上囊、脾、胸腺、骨髓、盲肠扁桃体、腺胃、肌胃、空肠、卵黄囊憩室、回肠、盲肠、直肠、心脏、肾、肺、肝、骨骼肌和皮肤,而在十二指肠和睾丸中没有检测到其转录。构建了鸡IL-2Rγ胞外区的原核重组表达载体,进行了表达和鉴定。     

论我国附带搜查制度的建构

附带搜查制度是现代刑事诉讼搜查制度令状主义原则的一个重要例外,为现代刑事诉讼所普遍确认。我国在建立附带搜查制度时,应借鉴英国、美国、日本等国家的相关规定,合理架构搜查制度体系,明确其启动的前提条件、时间限制、实质要件和范围限制,以弥补立法缺陷,满足侦查实践的需要。     

猪瘟的分子生物学诊断

采用RT PCR方法 ,从经临床和血清学初步诊断为猪瘟的病料中扩增了猪瘟病毒 (CSFV)的E2基因某一片段 ;对扩增片段进行序列测定 ,通过DNAsis软件构建了系统发生树 ,确定了这一流行株 (IPI株 )在系统发生树中的位置。结果表明 ,从IPI株和石门株 (Shimen)中均扩增出 2 71bp目标片段 ,这一流行株与我国 2 0世纪 90年代以来流行的绝大多数CSFV毒株同属于基因 2群中的 2 .1基因亚群 ,与YN1、YN2、GX4、GZ1的关系较近 ,而与Shimen株、兔化弱毒株 (HCLV)等我国传统的标准毒株相距较远。这一结果为猪瘟的诊断和检疫提供了一种特异、可靠的方法     

Developmental Validation of the Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit for Simultaneous Quantification of Total Human and Human Male DNA and Detection of PCR Inhibitors in Biological Samples*

Abstract: The Quantifiler^® Duo DNA Quantification kit enables simultaneous quantification of human DNA and human male DNA as well as detection of inhibitors of PCR in a single real-time PCR well. Pooled human male genomic DNA is used to generate standard curves for both human (ribonuclease P RNA component H1) and human male (sex determining region Y) specific targets. A shift in the cycle threshold (C_T) values for the internal positive control monitors the presence of PCR inhibitors in a sample. The assay is human specific and exhibits a high dynamic range from 0.023 to 50 ng/μL. In addition, the multiplex assay can detect as little as 25 pg/μL of human male DNA in the presence of a 1000-fold excess of human female DNA. The multiplex assay provides assessment of the DNA extract and guidance for the selection of the appropriate AmpFℓSTR^® Amplification Kit to obtain interpretable short tandem repeat profiles.     

死后不同时间大鼠心肌膈肌β肌动蛋白mRNA的检测

目的探讨死后不同时间心肌和膈肌β肌动蛋白mRNA(β-actin mRNA)的降解变化。方法大鼠断颈处死后置于21℃的温度控制系统,采用RT-PCR技术检测大鼠心肌和膈肌组织-βactin mRNA在死后即刻至12d的变化,并对电泳图像进行半定量分析。结果在死后即刻,以及保存2,4,6,8,10,12d的大鼠心肌组织样本中均可检测到β-actin mRNA,而膈肌组织仅在死后即刻和保存2,4,6d的样本中检测到-βactin mRNA;-βactin mRNA的扩增产物在死后12d内呈下降趋势。结论RT-PCR技术检测大鼠心肌和膈肌组织中的β-actin mRNA,其在死后12d内的降解呈现一定规律。