马动脉炎病毒的血凝性研究

在RK-13细胞上培养的马动脉炎病毒(Equine viral arteritis,EAV)在4℃、室温和37℃条件下,用多种动物的红细胞进行血凝试验,病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞,但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅的红细胞.将病毒用吐温-80和乙醚处理后,血凝活力会显著增强,其HA效价比未经处理的病毒高4-8倍,且血凝像更加清晰.处理病毒的最适条件是在冰浴状态下用终浓度0.6-1.25 mL/L吐温-80振荡处理15-60 min,再加1/2体积的乙醚振荡作用5-15 min.     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

Developmental validation of feline, bovine, equine, and cervid quantitative PCR assays

Accurate DNA quantification is essential for optimizing DNA testing and minimizing sample consumption. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays have been published for human and canine nuclear DNA, and the need for quantifying other forensically important species was evident. Following the strategy employed for the canine qPCR assay, we developed individual assays to accurately quantify feline, bovine, equine, and cervid nuclear DNA. Each TaqMan-based assay incorporates a genus-specific probe targeting the Melanocortin-1 Receptor gene and includes a piece of synthetic DNA that acts as an internal PCR control for detecting inhibition. Developmental validations were carried out following the revised guidelines of the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods with modifications necessary for validation of nonhuman qPCR assays. All assays demonstrated the specificity, sensitivity, stability, reproducibility, accuracy, and precision required for forensic casework. The application of these assays to animal forensic DNA analysis has both conserved laboratory resources and improved genotyping results.     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因 ORF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列,分别设计了2对引物,对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了 RT PCR;将扩增产物克隆于pUC18通用载体,对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果,ORF5目的片段包含768 bp,编码255个氨基酸组成的多肽;ORF6目的片段包含489 bp,编码162个氨基酸组成的多肽。与EAV NC 002532标准毒株比较,ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99.1%和99.4%;推导氨基酸的同源性分别为96.9%和98.2%。     

马动脉炎病毒膜蛋白基因截短型的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列,设计合成了 1 对引物,从 pUC 18 M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及 pGEX 6P 1 载体双酶切并连接,成功构建了原核表达载体pGEX 6P Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化;诱导后菌体裂解物经 SDS PAGE分析发现,在约 34 ku处出现了 1条特异性的蛋白条带,其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符,并随着诱导时间的延长而变化,在诱导后4 h达到高峰。结果表明,膜蛋白 M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。     

A case of multiple assignments (paternity/maternity) in an equine-out breeding system

Recently, the use of DNA markers has provided a more accurate method of identifying individuals and verifying parentage. In this report, we describe foal assignment in a farm bred jumping horses (Silla argentino). Ten mares were freely served by two stallions, resulting in nine foals. Weaning occurred without registration of the mare of each offspring, resulting in a failure to identify either the mare or the sire of each foal. Animals were typed using 12 microsatellite systems and four biochemical polymorphisms in order to determine the paternity/maternity of each foal. We used the CERVUS program to evaluate the parentage of each offspring. It was possible to determine maternity in eight cases, and paternity in all of them. We concluded that this set of codominant markers analyzed following a likelihood-based approach included in the CERVUS package, are useful tools to solve parentage assignments in domestic horses.     

Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响

将来源于马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株第25代和第118代病毒的LTR,白细胞弱毒(EIAV-DLA)的LTR,以及TAR起始碱基和/或poly(A)附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒(EIAV-FDD)的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中,获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT-FD、pCAT-G219A、pCAT-A294C和pCAT-G219A-A294C。同时用pcDNA3.1(+)构建了EIAV反式激活蛋白(Tat)基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞,考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明,在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性,而对白细胞源的LTR无明显增强作用;TAR起始位点和poly(A)的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。     

新疆马鼻肺炎的血清学调查

对新疆 11个地、州的 2 1个县 (市 )的 2 82 1份血清样品用微量补体结合试验进行了马鼻肺炎血清学调查。结果 ,仅在吉木萨尔县和奇台县境内检出 2 5份阳性血清。调查表明 ,虽然在新疆境内存在马鼻肺炎 ,但情况并不严重     

感染性分子克隆衍生的马传染性贫血病毒的免疫学特性

将马传染性贫血病毒驴白细胞毒疫苗(DLA EIAV)、DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)以及强弱毒嵌合毒(vOKVltr)分别接种健康马,并于接种后第 220 d,用 EIAV强毒辽宁株(L EIAV)攻击,观察临床变化,并测定接种后各结构蛋白的抗体变化。结果发现,攻毒后,2匹非免疫对照马和克隆衍生毒接种组中的 1 匹马体温均出现典型的稽留热并死亡,死亡马呈现典型的马传染性贫血的病理组织学变化,其他免疫马未见任何临床变化;在攻毒后第 450 d剖杀所有存活马,也未见任何病理组织学变化。抗体检测结果表明,免疫接种后攻毒前各组 p11 和 p9 抗体均检测不到,嵌合毒接种组p15、p26和gp45抗体水平高于其他组。攻毒后非免疫对照马体内抗p9、p11、p15、p26和 gp45抗体均显著升高,并持续至死亡;嵌合病毒接种马体内各结构蛋白抗体水平与攻毒前没有显著变化,克隆衍生毒接种马体内各结构蛋白抗体水平比攻毒前有所升高。通过临床观察、病理组织学检测以及攻毒后各结构蛋白抗体记忆反应情况分析,置换了强毒 LTR 的DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒(强弱毒嵌合病毒)免疫马能够抵抗马传染性贫血病毒强毒的攻击,获得完全保护,而DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒免疫马未能完全抵抗强毒的攻击。     

马鼻肺炎病毒双重PCR分型检测方法的建立

根据GenBank中登录的马鼻肺炎病毒1、4型(EHV1、EHV4)糖蛋白B(gB)基因特异保守序列(登录号分别为AY665713、AF030027.1),各设计1对引物,建立了同时分型检测EHV1、EHV4的双重PCR方法;确定其最佳工作条件,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。结果显示,在EHV1、EHV4中分别扩增出265bp和537bp的特异性目的条带,而马流感病毒cDNA、马动脉炎病毒cDNA、马乙型脑炎病毒cDNA及马传染性贫血弱毒疫苗株cDNA均未扩增出任何条带。EHV1的DNA最低检出限为2.1pg,EHV4的最低检出限为15pg。表明本试验建立的方法具备很高的应用价值。