Multiplex short tandem repeat amplification of low template DNA samples with the addition of proofreading enzymes

Abstract:  With <100 pg of template DNA, routine short tandem repeat (STR) analysis often fails, resulting in no or partial profiles and increased stochastic effects. To overcome this, some have investigated preamplification methods that include the addition of proofreading enzymes to the PCR cocktail. This project sought to determine whether adding proofreading polymerases directly in the STR amplification mixture would improve the reaction when little template DNA is available. Platinum Taq High Fidelity and GeneAmp High Fidelity were tested in Profiler Plus? STR reactions alone and in combination with AmpliTaq^® Gold. All reactions included the additional step of a post‐PCR purification step. With both pristine low template DNA and casework samples, the addition of these polymerases resulted in comparable or no improvement in the STR amplification signal. Further, stochastic effects and artifacts were observed equally across all enzyme conditions. Based on these studies, the addition of these proofreading enzymes to a multiplex STR amplification is not recommended for low template DNA work.     

A fast preparation of skeletal materials using enzyme maceration

The current study investigates the removal of soft tissues from mice and rats by the use of three different proteases and one lipase from Novozymes A/S. The results demonstrate the enzyme maceration to be remarkably fast (1-3 h) compared to the traditional warm-water procedure, which requires up to several days. In addition, the enzyme maceration eliminates the odor problem associated with the traditional procedure. It is shown that stirring of the enzyme maceration bath is the main factor which determines the speed of the maceration. For mice, the time required for enzyme maceration can vary from 1 to 8 h depending on the stirring speed. The method investigated here allows preparation of skeletal material in an essentially odorless way within a matter of hours, making the method useful in particular for forensic science, private conservation workshops, and educational purposes.     

灯盏花注射液对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的：研究灯盏花注射液对避灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察灯盏花注射液对血清胞浆酶及fos蛋白表达的影响。结果：脑缺血现后血清胞浆酶含量及foa蛋白表达显增加（P＜0．01）；灯花注射液可明显降低脑缺血再灌注后血清胞浆酶含量，下调fos蛋白的高表达（P＜0．01），结论：灯盏花注射液对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与其犯罪 清胞浆酶及下调fos蛋白高表达有关。     

外伤性癫痫灶中泛素蛋白酶体系的形态学改变

目的检测泛素(ubiquitin,Ub)和泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme1,UbE1)在外伤性癫痫灶中的表达,探索其对鉴定外伤性癫痫的应用价值。方法收集脑外伤后癫痫灶皮质样本15例(外伤性癫痫组)、非脑外伤后癫痫灶皮质样本15例(非外伤性癫痫组),交通事故死亡正常脑皮质样本15例(非癫痫组),通过HE常规染色观察各组形态学改变,用免疫组化染色检测3组中Ub和UbE1的表达情况。结果常规HE染色下,与非癫痫组相比,外伤性癫痫组和非外伤性癫痫组出现神经元数量减少、神经元变性等形态学改变,外伤性癫痫改变更明显。Ub和UbE1主要表达在癫痫灶神经元细胞核、细胞质内,细胞外未见表达。图像分析显示两指标的表达量为外伤性癫痫组非外伤性癫痫组非癫痫组,差别具有统计学意义(P0.05)。结论正常神经元数量减少、神经元变性是癫痫灶的主要病理改变之一,外伤性癫痫神经元病理改变更明显。与HE染色比较,Ub和UbE1免疫组化染色更灵敏,有助于鉴别外伤性癫痫和非外伤性癫痫。     

类固醇合成相关酶在小鼠不同组织中的表达

利用RT-PCR和Western-blotting技术分析了胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟甾脱氢酶(3-βHSD)、C17-20裂解酶(P450c17)、StAR mRNA和蛋白在成年昆明小白鼠心脏、脾、肝、肾中的表达。结果显示,StAR mRNA及其蛋白、P450scc mRNA在以上组织中均有表达;3-βHSD在肾中有较强的表达,在其他组织的表达较弱;P450c17在上述组织中无明显的表达,但在睾丸中有明显的表达。这表明,心脏、脾、肝、肾均具有合成类固醇的能力,但合成类固醇的类型存在一定的差异。     

MA与HIV-Tat协同作用致大鼠相关脑区ROS、GSH-PX和SOD的变化

目的 观察甲基苯丙胺(MA)与HIV-Tat蛋白协同作用致大鼠相关脑区活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的变化,探讨协同作用对神经系统的影响.方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为实验组:MA组(10mg/kg MA,每日两次腹腔注射,连续4d)、HIV-Tat组(10μg HIV-Tat注入大鼠脑纹状体)和MA+HIV-Tat组(按MA组注射MA 4d后按HIV-Tat组注入HIV-Tat);对照组:生理盐水腹腔注射或纹状体内注射.各组大鼠分别于注射结束后48h和7d处死,取各脑区脑组织制作匀浆;荧光分光光度计检测ROS含量,酶标仪检测GSH-PX和SOD吸光度,再根据蛋白质的浓度分别计算其活力.结果 各实验组与对照组比较,各脑区ROS含量有不同程度增高,GSH-PX和SOD活力则有不同程度下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);其中MA+ HIV-Tat组与MA组和HIV-Tat组比较,ROS含量升高显著,GSH-PX和SOD活力下降明显(P＜0.01).结论 MA和HIV-Tat协同作用能够产生大量的ROS,并降低GSH-PX和SOD的活力,揭示ROS、GSH-PX和SOD参与了MA与HIV-Tat的协同神经毒性作用.     

桑叶提取物对大鼠体内细胞色素P450酶活性的影响

目的 采用“Cocktail”混合探针药物法,探究桑叶水提物（aqueous extract of mulberry leaves,AML）、桑叶醇提物（ethanol extract of mulberry leaves,EML）对大鼠体内细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）酶活性的影响,从代谢酶的角度预测它可能引起的药物相互作用,为临床合理用药提供参考。方法 选用非那西丁、安非他酮、双氯酚酸钠作为大鼠体内3种CYP450酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9）的探针药物。雄性SD大鼠连续灌胃桑叶提取物14 d,第14天灌胃后30 min尾静脉注射混合探针药物,根据不同时间点采血。采用超高效液相色谱- 串联质谱测定各组血药浓度,用DAS 2.0和SPSS 21.0软件拟合药物代谢动力学参数并进行统计学分析。结果 连续灌胃桑叶提取物14 d后,与9.0 g/L氯化钠注射液相比,AML组中非那西丁、双氯酚酸钠代谢减慢,安非他酮则不明显;与羧甲基纤维素钠组相比,EML组中安非他酮、双氯酚酸钠代谢减慢,非那西丁则不明显。结论 AML对大鼠体内CYP1A2、CYP2C9可能存在一定的抑制作用,对CYP2B6可能无显著性影响;EML对大鼠体内CYP2B6、CYP2C9可能存在一定的抑制作用,对CYP1A2可能无显著性影响。     

用多种探针药物评价穿心莲对鸡药物代谢酶活性的影响

采用咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗、奥美拉唑药物探针法,测定这些探针药物在鸡体内的消除半衰期,以探讨穿心莲超微粉对鸡的药物代谢酶的影响,结果显示,对照组和试验组的咖啡因t1/2β分别为632min、415 min,表明两组的t1/2β之间有显著差异(P<0.05).对照组与试验组的氨苯砜t1/2β分别为55.4 min、48.4 min,二者之间差异不显著(P>0.05).对照组和试验组的奥美拉唑t1/2β分别为16.5 min、7.6 min,表明两组的消除半衰期差异极显著(P<0.01);氯唑沙宗t1/2β分别为26.3 min、20.5 min,两组差异显著(P<0.05).结果表明,穿心莲超微粉对CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1和CYP2C19的活性都有诱导作用,但与对照组相比,对CYP3A4的诱导作用差异不显著,而对CYP2C19的诱导作用差异极显著.