| 摘 要： | 为建立一种灵敏、特异、快速地检测虾肝肠胞虫的方法,以虾肝肠胞虫的保守序列为靶序列,利用Primer Premier 5.0和Primer Express 2.0软件分别设计引物和TaqMan探针,开展了虾肝肠胞虫的TaqMan荧光定量PCR检测技术研究。将虾肝肠胞虫目标片段克隆到p MD 19-T载体上构建重组质粒,然后以10倍梯度稀释的重组质粒作为标准品。根据标准品拷贝数与Ct值的关系绘制标准曲线,其斜率为-3.239,相关系数r~2=0.996。重复性试验结果表明,该方法 Ct值的变异系数为0.94%~1.13%,具有良好的稳定性。特异性检测结果显示,该方法对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌、微孢子虫感染的对虾肌肉组织等的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性。应用建立的方法对宁波和嘉兴地区15批凡纳滨对虾样品进行检测,发现有6批感染虾肝肠胞虫。利用标准曲线对感染虾肝肠胞虫的虾不同组织进行了定量分析。本研究建立的虾肝肠胞虫TaqMan荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对虾肝肠胞虫病的快速诊断与病原定量检测有重要意义,可广泛应用于实验室和现场快速检测。
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