| 摘 要： | 为构建基于Ⅱ内体靶向性的PCV2多表位疫苗,并进行免疫活性鉴定。选取7个PCV2中和表位,组成表位串联体,采用DNA Star Protean优化组合方式及密码子优化,合成ep c DNA,定向插入p EG X-4T-1;通过三轮PCR重叠延伸构建ep置换CLIP区的ep+Ⅱ重组体,经X hoⅠ、X baⅠ位点定向克隆至pCI-neo多克隆位点处,构建真核表达载体pCI-neo-ep+Ⅱ;转染CO S-7细胞,免疫荧光、W estern-blot鉴定Ⅱ内体靶向功能与ep表达蛋白免疫活性;提取pCI-neo-ep+Ⅱ免疫BALB/c小鼠,ELISA方法测定血清抗体,评价其免疫效力。结果显示,优化确定PCV2 ep串联体c DNA大小为300 bp,编码100位氨基酸残基,并成功构建了p EGX-4T-1-ep重组体;三轮PCR置换构建了ep完整替换CLIP区ep+Ⅱ重组体,大小为873 bp,无Ⅱ、ep基因缺失和突变。免疫荧光抗体检测显示,Ⅱ内体靶向功能不受置换ep影响;Western-blot鉴定表明,ep+Ⅱ重组蛋白获得有效表达,目的蛋白大小约32.1 ku,其与PCV2阳性血清具有良好的免疫反应性。小鼠免疫试验显示,pCI-neo-ep+Ⅱ免疫ELISA抗体效价可达1∶1 600,明显优于非靶向性pCI-neo-ep的1∶1 200。结果表明,构建了具有内体靶向性PCV2多表位疫苗,明显提高表位疫苗免疫抗体效价,为PCV2新型疫苗研究奠定了基础。
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