| 摘 要： | 本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsa_(m4)。将Gcsa_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsa_(m4)。利用Western-blot检测rcsa_(m4)与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsa_(m4)与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsa_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsa_(m4)主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85μg/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×10~3μg/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsa_(m4)后,每毫升的一免兔血清可中和50～70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsa_(m4)在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。
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