产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA方法的建立

为建立绵羊产气荚膜梭菌ε毒素抗体间接ELISA检测方法，对D型产气荚膜梭菌（C60-1株）的ε毒素基因进行扩增，构建pET-32a-ε重组质粒，转入BL21(DE3)PlysS诱导蛋白表达，经Ni柱纯化后获得可溶性ε毒素重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，对ELISA反应条件进行优化，并对该方法的特异性、敏感性、重复性和临床检测中的应用进行验证。结果显示，重组蛋白包被浓度为0.5μg/m L，封闭液为1%BSA，待检绵羊血清1∶100稀释，家兔抗山羊HRP酶标二抗1∶5 000稀释，显色液避光显色20 min为最佳反应条件。测定45份阴性血清，计算其平均值（X）和标准差（SD），确定所建立的ε毒素抗体间接ELISA方法的阴阳性临界值（X+3SD）为0.254。检测阳性血清敏感度为1∶3 200，批间和批内重复率显示，变异系数均小于10%，特异性试验显示，检测羊痘病毒（SPV）、蓝舌病病毒（BTV）、羊布鲁氏菌、沙门菌和绵羊肺炎支原体均没有特异性反应。检测90份临床羊血清样品，该间接ELISA方法与商品化试剂盒之间的阳性符合率为82.9%，阴性符合率为95%，总符合率为85.6%。结...