鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位

克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板，用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后，连接至pGEM-T Easy载体；测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)；经双酶切和测序鉴定后，将重组菌诱导表达；表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后，免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体；利用多克隆抗体，分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位；最后，应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长549 bp，编码183个氨基酸，预测分子质量为20.3 ku；重组蛋白主要以包涵体形式存在，可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别；在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白，分子质量约为36 ku;EnsHsp2...