基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

参考甲型塞内卡病毒（SVA）CH/HuB/2017株全基因组序列，构建SVA通用型载体，合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段，并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体，获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA；经双酶切和测序验证后，在IBRS-2细胞上进行转染和传代，以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017；经遗传稳定性评价后，利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验，鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示，重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2，即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株，且具有良好的遗传稳定性；拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明，通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统，可以在质粒水平快速编辑病毒基因组，为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。