表达牛分枝杆菌esat-6和cfp-10基因的重组流产布氏杆菌S19疫苗株的构建及毒力评估

通过overlap PCR扩增了含有bp26基因上游片段、bp26基因下游片段及牛分枝杆菌esat6-cfp10基因的目的片段Δbp26-ec,利用含有sacB基因的自杀质粒pRE112为载体,通过等位基因交换的方法,将构建好的自杀质粒电转入已经构建好的缺失bp26基因的流产布氏杆菌减毒活疫苗S19突变株中,构建了具有非抗性基因标记的突变株S19-Δbp26-ec,并对构建好的新型基因突变株进行了生物学特性及毒力的鉴定及分析。PCR及核苷酸序列测序结果显示,S19-Δbp26-ec构建成功。与亲本株相比,疫苗株S19-Δbp26-ec的生长特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示,S19-Δbp26-ec株具有良好的遗传稳定性。被感染小鼠脾重和脾中菌落数表明,S19-Δbp26-ec的毒力最弱,S19和S19-Δbp26次之。上述结果表明,本试验获得了毒力减弱的基因突变株S19-Δbp26-ec,为牛布氏杆菌病-结核病二联疫苗的研制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpoN基因的功能奠定了基础。     

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建

为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。     

鸭疫里氏杆菌CH3株ompA基因缺失株的构建及其部分生物学特性的研究

为了分析OmpA缺失对鸭疫里氏杆菌生物学特性的影响,采用自杀质粒同源重组的方法构建了CH3株的ompA基因缺失株。用PCR方法扩增ompA基因左右两侧的同源臂和壮观霉素抗性基因表达盒后连入自杀性质粒pDS132,构建得到重组自杀质粒pDS132-ompA-LSR。再通过双亲本接合转导的方法将此重组质粒导入到CH3株,用含卡那霉素和壮观霉素的TSA筛选可能的基因缺失株,并用PCR和Western-blot进行鉴定,获得基因缺失株CH3ΔompA。生物学特性分析表明,OmpA缺失后鸭疫里氏杆菌对盐离子浓度的耐受能力降低、对抗生素的敏感性增强,而对去污剂SDS、EDTA和酸碱(pH)耐受性没有明显的影响。     

减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株的构建及其对雏鸡的免疫活性

为构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株Δcrp基因缺失突变株,并初步观察ΔcrpC79-13缺失菌株作为活疫苗对雏鸡的免疫活性,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的ΔcrpC79-13缺失菌株;通过半数致死量测定其毒力;给4日龄雏鸡口服免疫缺失菌株,在不同时间点根据胸腺、法氏囊、脾等免疫器官发育和平均日增重、外周血淋巴细胞转化试验、Griess法NO测定及血清IgG动态观察免疫水平。结果显示ΔcrpC79-13的毒力较C79-13降低约99.6%(LD50>5.0×109CFU);雏鸡接种ΔcrpC79-13(1.0×109 CFU/只)后不影响雏鸡生长,第14～21天体内特异性细胞和体液免疫水平达到最高。表明成功构建了减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株,其毒力显著降低,免疫雏鸡安全,具有良好的免疫活性。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

乳牛前脂肪细胞原代培养过程中ADPN基因和HSL基因表达水平的检测

选取犊牛大网膜脂肪组织,进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养,在细胞接种后第4、6、8、10、12、141、6 d分别提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测了体外培养的犊牛前脂肪细胞不同时期ADPN基因mRNA和HSL基因mRNA的表达情况。结果表明,单层培养的脂肪细胞在第4、6、8、10、12、141、6 d,ADPN基因mRNA的表达水平呈先下降后升高的趋势,而HSL基因mRNA的表达水平则呈下降趋势。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

猪PD-1分子及其配体的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪程序性死亡因子PD-I及其配体PD-LI和PD-L2的基因序列,分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以10倍系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,对实时荧光定量PCR的条件进行优化,以建立定量检测这3个基因的方法.结果表明,建立的方法在1×10~2～1×10~8copies/μL模板范围内具有良好的线性关系(r~2>0.99),扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品.利用该方法对猪外周血单核细胞中这3个基因的表达情况进行了检测,结果也表明该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可应用于临床样品的检测.     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M