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鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。 相似文献
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采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。 相似文献
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为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。 相似文献
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以重组质粒pET-fliC和pUC57-M2e2为模板,通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+,获得重组质粒pET-fliC/M2e2,将其转化鼠伤寒沙门氏菌LB5000,获得重组菌LB5000(fliC/M2e2)。应用P22噬菌体转导技术,将fliC/M2e2基因导入都柏林沙门氏菌SL5928的基因组中,经生化血清学鉴定、动力学测定、透射电镜观察、Western-blot分析,将阳性转导菌命名为SL5928(fliC/M2e2)。提取重组菌鞭毛蛋白fliC/M2e2作用HEK293-mTLR5细胞,能刺激细胞分泌IL-8。将fliC/M2e2通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠,50μg/只。结果显示,二免后第14天,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组的血清抗体效价与对照组之间呈现显著性差异(P<0.05)。ELISPOT结果表明,在脾细胞中,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,且免疫应答以Th1型为主。结果表明,构建的fliC/M2e2嵌合基因能够在沙门氏菌中表达,重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2能激发机体针对M2e表位的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。 相似文献
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对编码结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的基因片段进行了扩增,并将其克隆入穿梭载体DKSV7,利用基因同源重组技术构建了表达结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的重组产单核细胞李斯特菌(LM).结果表明,外源基因成功整合入LM基因组并获得转录;Western-blot分析结果显示,重组菌携带的外源基因在动物体内能够表达;溶血试验与细胞感染试验表明,较之野生型李斯特菌,外源基因的插入破坏了重组菌LM(pKSV7-H85-6B)的溶血活性,显著降低了对细胞的侵袭能力.证实,携带结核分枝杆菌保护性抗原Ag85B和ESAT-6的重组李斯特菌对结核病新型疫苗的研究具有潜在应用价值. 相似文献
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鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。 相似文献
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将空肠弯曲菌NCTC11168基因组用Sau3AⅠ部分酶切,回收400~3 000bp的片段。用BamHⅠ酶切原核表达载体pET30a(b,c),用SAP去磷酸化后,切胶回收线性载体片段。将基因组片段与载体按摩尔比例10∶1连接,转化DH5α感受态细胞,PCR分析插入片段大小的分布和插入的正确率。从转化的平板上提取质粒,转化表达宿主菌BL21(DE3),获得基因组表达文库。用IPTG诱导BL21(DE3),SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。提取基因组,以0.5U/μg Sau3AⅠ于37℃部分酶切基因组,回收400~3 000bp片段。载体用2.5U/μg BamHⅠ线性化后,用0.8U/μg SAP将其完全去磷酸化。基因组片段与载体连接转化DH5α感受态细胞,获得了基因组表达文库,库容达52 700个克隆,可以覆盖弯曲菌全基因组4次以上,片段插入正确率为83.3%~91.7%,片段大小为400~3 000bp,且均匀分布,IPTG诱导表达文库后蛋白呈现高效表达,表明成功构建了空肠弯曲菌的基因组表达文库。 相似文献