H3N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Heilongjiang/1/2005(H3N2)的反向遗传操作技术平台,利用RT-PCR扩增了H3N2亚型猪流感病毒的8个基因片段,分别连接到pBD双向转录表达载体上。将8个重组质粒纯化后,共转染293T细胞,48h后收集上清,接种MDCK细胞。当MDCK细胞呈现明显病变时,收集上清,做血凝试验,检测出有血凝现象。通过MDCK细胞病变情况、生长曲线、空斑形态等验证拯救病毒的可靠性,结果发现:野生毒株和拯救毒株在MDCK细胞上引起的病变情况基本一致,生长曲线的测定结果没有明显差异,空斑形态也极其相似。H3N2亚型猪流感病毒的成功拯救为猪流感病毒的致病机理、传播机制、基因功能研究以及疫苗研发奠定了基础。     

Clade2.3.4 H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建

为应对Clade2.3.4H5亚型禽流感病毒持续发生的抗原性改变及其引发的潜在的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果制备疫苗候选株。采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的内部基因为骨架,以Clade2.3.4H5N1亚型AIV A/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因为供体,并删除wt-HB株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,成功拯救出1株重组病毒rHB/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡和鸡胚无致病性。这一研究结果为防控变异的Clade2.3.4H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。     

禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒的系统进化和分子遗传特征分析

为了解在江苏某湿地野生水禽中分离到的1株禽流感病毒的来源、流行特点、进化和分子遗传特征,将采集的野生水禽粪便经处理后,使用A型禽流感通用荧光RT-PCR检测,阳性样品接种10日龄SPF鸡胚,收取接种后第24~96小时的尿囊液,进行血凝试验,随后对其进行全基因测序和遗传进化分析。结果显示,该毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)。HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PEKQTR↓GLF,无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;HA与NA的糖基化位点没有发生突变;NA耐药性氨基酸位点出现突变位点;PB2蛋白第627和701位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asn),是禽源流感病毒的特征性氨基酸。在Gen Bank中对该毒株进行序列比对分析,结果显示,与所测基因片段同源性最高的10株毒株基本位于我国东部候鸟迁徙路线上。结果表明,A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)株为从江苏分离的低致病性禽流感病毒,基因主要来源于我国东部候鸟迁徙路线上的禽流感病毒。     

乌鸡新城疫病毒中发型毒株的分离与鉴定

从发病的 43日龄乌鸡群中分离到 1株病毒 ,经鸡胚传代培养后 ,测定其F3 代尿囊液血凝 (HA)效价为 2 8,HI试验中能被鸡ND阳性血清中和 ,鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 60 .8h ,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 0 .8,血凝解脱时间小于 10min ,血凝素热稳定性差。表明该分离株为新城疫病毒中发型毒株。     

针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析

针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。     

鸭源H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

H5N1亚型clade 2.3.4为我国南方地区的优势毒株.A/mallard/Huadong/S/2005(S)病毒在遗传进化上属于clade 2.3.4,而A/mallard/Huadong/Y/2003(Y)病毒属于clade 2.通过删除S病毒和Y病毒的HA多碱性氨基酸序列,S病毒由PLRERRRKRGL改变为PLREGRGL,Y病毒由PQRERRKKRGL改变为PQREGRGL,使之成为低致病性特征的HA基因.将S病毒和Y病毒的NA基因和突变的HA基因分别组合,由A/Puerto Rico/8/34(PR8)病毒提供6个内部基因,进行拯救,共获得4个致弱病毒(SS,SY,YS,YY).这4个致弱病毒对SPF鸡的静脉内致病指数(IVPI)为0,对10日龄SPF鸡胚无致病性.SS、SY、YS、YY病毒第10代鸡胚尿囊液的HA效价分别为9、11、11、11 1b.     

H3N2犬流感病毒PB2 D701N位点突变对小鼠致病性的影响

为探究PB2基因D701N突变对犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)H3N2的致病性影响,利用本实验室构建的CIV H3N2(A/canine/Guangdong/02/2011,C/GD/02)反向遗传系统和定点突变技术,获得了2株拯救病毒(原毒株:r C/GD/02,突变株:r C/GD/02-701N)。聚合酶活性试验结果显示,突变株的聚合酶活性显著强于原毒株(P0.05),说明PB2 D701N的突变能显著增强CIV H3N2聚合酶活性;病毒生长曲线显示,突变株比原毒株在MDCK细胞中的生长复制能力有所下降;小鼠致病性试验显示,两毒株均导致了小鼠的体重增长速率轻微下降,但毒株间无显著差异,且均未导致小鼠死亡。结果表明,PB2基因D701N的突变不会显著影响CIV H3N2对小鼠的致病性。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.