对《煌绿激发试验引起死亡初报》一文的不同看法

兔巴氏杆菌病(Pasteurellosis cuniculum)又称兔出血性败血症或兔传染性鼻炎,其病原体为多杀性巴氏杆菌,通常存在于健康兔的上呼吸道及消化道内。当家兔抵抗力强,外界环境良好时,不易致病。当外界环境恶劣,饲养管理不良,家兔体质差,抵抗力减弱时,此菌乘机活动,引起发病。统计资料表明,该病是引起9周龄至6月龄的兔死亡的最主要原因。为了预防和治疗目的,必需做出生前或病前诊断。煌绿滴鼻试验是多种:日刊介绍的诊断兔巴氏杆菌病的一种方法。《中国兽医科技》(原《兽医科技杂志》)1982年第11期刊登宋兆敏的《煌绿激发试验引起死亡初报》(以下简称《初报》)的文章,对煌绿滴鼻进行了否定,使兽医临床莫衷一是,不知其可。工作的需要,要求我们做兔巴氏杆菌病生前诊断、病前诊断、所以对《初报》进行了研究、推敲,认为其所谓“假阳性”理由不能成立,致死滴鼻兔不能排除药物以外的     

血液直接培养快速诊断兔巴氏杆菌病

(一)材料和方法 1.试验菌株:采用3株多杀性巴氏杆菌,C48—1菌株由中国兽药监察所提供,C8709(猪源)和Y8608(鸭源)菌株均系我们从自然病例分离的地方菌株,菌落荧光型,前者为Fg型,后者为FO型。 2.试验兔:系未注射过巴氏杆菌疫苗的健康家兔,体重1.5kg左右,试验前煌绿滴鼻呈阴性反应。 3.采血瓶;洁净青霉素瓶内装4～5个玻珠(直径约0.5cm),加塞后用胶布牢固固定,高压灭菌备用。     

煌绿激发试验引起死亡初报

动物试验是对巴氏杆菌病进行细菌学诊断的常用方法之一,在实验动物中小白鼠和家兔对哺乳动物的各种巴氏杆菌均富有感受性。《兽医微生物学》(吉林农业大学主编,189页,农业出版社,1961年)。《养兔学》(张家口农专主编,188页,农业出版社,1981年)、《家兔传染病》(张家口农专编,17页,1977年)、《兽医检验》(解放军兽医大学编,655页,农业出版社,1979年)各书中规定:进行动物实验如果选用家兔时,在接种前数日,应每天以0.2～0.5％煌绿溶液2～3滴,滴注于鼻腔内,经18～24小时后检查,有化脓性鼻炎者为阳性,此种家兔不宜作实验感染用。但是我们依照上述规定进行试验时,却发现可以引起家兔大批死亡。为了查明原因,笔者以各种浓度的煌绿溶液进行多次反复试验。现将结果报告如下。     

兔中耳炎的诊断和治疗

细菌学诊断 ①采取新鲜脓性分泌物作病料涂片,以Loeffler氏美蓝液染色,发现典型的两极着色小杆菌,即可初步确诊。②培养:接种病料于血液琼脂上,孵育24h后,发生不溶血的稍透明的小菌落,制成涂片,染色,镜检,发现革兰氏阴性,两极着色的小杆菌,即可确诊。③动物试验:将被检病料或脑组织磨细用灭菌生理盐水作1:5～1:10稀释,给小白鼠皮下注射0.2ml,于48h内死亡,剖检内脏器官呈败血症病理变化。如果给家兔鼻腔内滴注0.2％～0.5％煌绿液2～3滴,如为巴氏杆菌带菌者,则在滴注后18～24h出现化脓     

兔瘟巴氏杆菌魏氏梭菌三联灭活苗的研制与应用

用人工感染兔瘟病兔的肝、脾、肾及从患急性巴氏杆菌病和魏氏梭菌性肠炎病兔分离的细菌制成氢氧化铝甲醛灭活苗（兔三联苗）。试验兔于免疫后７、５０、１００和１８０天时均能抵抗致死量兔瘟强毒的攻击；在免疫后２０天时全部能抵抗１０个最小致死量的兔巴氏杆菌培养物的攻击，经７５天保护率也为１００％；免疫后４５天用魏氏梭菌培养物攻击，其保护率为１００％；免疫后１２０天分别用兔巴氏杆菌与魏氏枝苗培养物攻击，其保护率均为７５％。该疾苗有效保存期为４～６℃１０个月，１０～１５℃６个月，１８～２５℃３个月。在流行兔瘟、已氏杆菌病、魏氏梭菌病的兔场试用该疫苗免疫家兔，在免疫后７天至８个月内能有效地预防这几种传染病。     

家兔流行性巴氏杆菌化脓性肺炎的诊疗

由巴氏杆菌引起的家兔化脓性肺炎在临床上仅见散发的病例,呈地方流行性者罕见。1987年8月至1988年2月,浙江某地家兔发生了以流脓性鼻液、打喷嚏为主要症状,以胸腔积脓,肺脓肿为主要病变的巴氏杆菌病,发病率达60.7％。曾用各种抗菌药物治疗均无显著效果,后用分离到的病原菌株制成灭活菌苗给兔群进行预防注射,才使疫情得到控制。     

鉴别家兔多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏菌的双重TaqMan qPCR方法的建立

为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR方法,并初步用于检测家兔肺脏及鼻拭子临床样本。结果显示,该方法建立的标准曲线在标准品浓度为2.35×10~6～2.35 copies/μL时有良好的线性关系;与绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌无交叉反应;最低检测限均为2.35 copies/μL;批内、批间重复性检验变异系数均小于2%。检测70份临床样本DNA结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为50.0%,支气管败血波氏菌阳性率为42.9%,混合感染率为21.4%,该方法与细菌分离培养和常规PCR符合率分别为80.0%、 92.0%。以上数据表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,无需病原菌的培养即可用于临床样品的快速检测,为兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、高效、准确的检测方法。     

兔瘟巴氏杆菌波氏杆菌三联苗的研制

介绍了兔瘟（ＲＨＤ）、巴氏杆菌（Ｐｍ）、波氏杆菌（Ｂｂ）三联苗的生产工艺和免疫效果。试验兔用该苗１ｍＬ免疫后，在５，７，１２０，１９５ｄ均能抵抗致死量兔瘟强毒的攻击，保护率为１００％；对巴氏杆菌和波氏杆菌，免疫后１０ｄ能产生较强的免疫力，近期保护率分别为８３．３％和８７．９％，免疫后１９５ｄ保护率分别为７２．７％和７６．９％。该苗有效保存期在宁夏银川的室温阴凉处（６～２２℃）为１８０ｄ，在０～８℃冰箱为３６５ｄ。经野外免疫３０００多只家兔表明，该苗安全可靠，在免疫后７～１８０ｄ内能有效控制这３种传染病。     

兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性

对从山东某獭兔养殖场病死仔兔肺中分离的1株疑为巴氏杆菌菌株进行了菌落形态学观察及培养特性、革兰氏染色、生化反应、仔兔致病性回归试验、小鼠毒力试验,并采用PCR方法对该分离株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰氏染色阴性,生化试验及PCR鉴定结果显示为F型多杀性巴氏杆菌,能引起獭兔仔兔肺出血、坏死,并致部分仔兔死亡。表明该分离菌株为比较少见的兔F型多杀性巴氏杆菌。     

检测鸭甲型肝炎病毒3型的免疫组织化学方法的建立和应用

收集鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV3)接种10日龄鸭胚后死亡胚体的尿囊液,用差速离心法获得纯化的DHAV3抗原免疫家兔后制备家兔抗DHAV3超免疫血清,提取家兔抗DHAV3IgG,成功建立和优化了检测DHAV3的免疫组织化学方法。该法能够检测DHAV3感染雏鸭肝组织的病毒抗原,阳性信号主要分布于受感染细胞的细胞质,而用它检测鸭瘟病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病死亡雏鸭和健康雏鸭时则呈现阴性反应。应用该方法对临床确诊并经福尔马林溶液保存的5份DHAV3感染雏鸭的肝、脾、肾、小肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺的样品进行检测,结果均为阳性。以上试验结果表明,该方法具有良好的特异性,可用于DHAV3感染雏鸭的临床诊断和福尔马林溶液固定样品的回顾性诊断。     

家兔乙肝表面抗原的自然携带和实验感染的研究

用ELISA和R-PHA方法检测家兔血清中HBsAg,结果从317份兔血清中发现6份阳性,血凝滴度1:16～1:64,阳性率1.9％,并同时发现抗-HBc阳性,SGPT升高。对5只健康家兔用HBsAg阳性人血清感染后,第28天有2只HBsAg阳转,阳转率40％,第52、64天采血检测,除1只HBsAg保持低滴度外,抗-HBs先后转为阳性,滴度为1:16～>1:128。结果表明,家兔在自然界或实验条件下,均可感染HBsAg,对寻找乙肝动物模型提供了一条新的途径,同时,对预防人、畜间乙型肝炎病毒的互传提供了科学依据。     

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理,采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51-17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pm9616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因,并对其进行序列分析。将C51-17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中,将重组表达载体pET30a-prfA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95.6%~100%,在氨基酸水平上的同源性为98.9%~100%。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45.6ku,与预期的大小一致,以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应,具有良好的反应原性。     

家兔巴氏杆菌病免疫的研究——PC弱毒株冻干菌田间免疫试验

用巴氏杆菌PC弱毒株试制的冻干菌苗(以下简称PC冻干苗)已对家兔进行了安全性、免疫原性、稳定性、效力及免疫期等一系列试验获得了比较满意的结果,在此基础上又进行了田间免疫试验,现将试验结果报告于下: 试验材料 (一)试验动物 ①兔:实验室用的肉兔有成、年青紫蓝兔、日本大耳兔、中国本兔;     

产毒素多杀巴氏杆菌在猪萎缩性鼻炎病因中的作用研究——支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀巴氏杆菌对仔猪的实验感染

本试验用约8万个以上支气管败血波氏杆菌Ⅰ相活菌滴鼻感染1周龄仔猪,产生了严重的鼻甲骨萎缩,但不发展成持续性临床型萎缩性鼻炎。相反,仔猪先用致中等度鼻腔病变(约6万个活菌)甚至肉眼不明显病变(约5千个活菌)以下的支气管败血波氏杆菌滴鼻感染后,再接种产毒素多杀巴氏杆菌,则产生严重至完全的鼻甲骨萎缩,并有临床型病例出现,与自然感染发病相同,实验结果证实,产毒素多杀巴氏杆菌可以起到加剧支气管败血波氏杆菌引起的猪萎缩性鼻炎病演过程的作用。结论认为,这两种细菌在猪鼻腔的混合感染是持续性临床型萎缩性鼻炎的病因。     

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。     

牛隐孢子虫病的研究——免疫琼脂扩散试验

采用蔗糖不同密度梯度离心分离牛隐孢子虫卵囊,超声波加冻融裂解,制备可溶性和颗粒抗原,与参考阳性血清和免疫家兔血清呈阳性反应;与参考阴性血清和从非疫区采集的30份犊牛血清呈阴性反应;对牛焦虫病血清、球虫病血清、轮状病毒性肠炎血清均无交叉反应;对被检测的96份自然感染隐孢子虫犊牛血清阳性检出率为81.25％;对42份实验感染隐孢子虫雏鸡血清阳性检出率为78.57％。初步证明用免疫琼脂扩散试验诊断牛隐孢子虫病是可行的。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

产毒素多杀巴氏杆菌在猪萎缩性鼻炎病因中的作用研究——支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀巴氏杆菌混合感染方式对猪萎缩性鼻炎发生的影响

本试验结果证明,仔猪实验感染支气管败血波氏杆菌(Bb)后再接触感染产毒素多杀巴氏杆菌(Pm);或自然感染Bb后再实验感染产毒素Pm;或实验感染产毒素Pm后再接触感染Bb,均可产生严重的鼻甲骨萎缩和临床症状。     

趋化因子配体5及趋化因子受体5在人工感染多杀性巴氏杆菌的鸡脾内的动态表达

给20日龄伊莎褐蛋鸡皮下注射多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)建立了禽霍乱动物模型,以感染后第4、12、24、48、120小时为时间点采样,运用病理学技术和免疫组织化学方法,研究被感染鸡的肝、脾病理学变化及脾内趋化因子配体(CCL5)及趋化因子受体5(CCR5)的动态表达。结果显示,雏鸡感染多杀性巴氏杆菌后发现明显局灶性肝坏死和脾内淋巴细胞减少,脾内CCL5和CCR5的表达量在感染后第48小时明显上升,尤其是感染后第24小时表达量最高,均明显高于对照组(P0.05),且与病变严重程度呈正相关。感染后第120小时趋于正常。结果表明,多杀性巴氏杆菌可以刺激蛋鸡脾内CCL5和CCR5表达的一过性上调,这种反应在禽霍乱鸡的肝、脾损伤过程中可能发挥重要的生物学作用。     

一种培养多杀性巴氏杆菌的新方法

巴氏杆菌在组织涂片中,用美蓝、瑞特氏或姬姆萨染色呈两极浓染,但人工培养后这种现象即消失。因此人们为了观察菌体两极浓染以鉴定巴氏杆菌,长期以来都是将该菌接种试验动物,再取其病料涂片检查。这种方法费时且不经济,迄今国内外亦无新方法报道。我们将多杀性巴氏杆菌接种到脱纤血内培养,用这种培养物涂片染色镜检,获得满意效果。