猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

猪伪狂犬病病毒FJNP株的分离鉴定

从福建省某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种PK细胞的结果显示,PK细胞出现典型的细胞病变;PCR反应扩增出特异性的片段,与经典毒株闽A株一致;免疫荧光试验中出现绿色荧光;病毒接种家兔后引起典型的伪狂犬病症状并死亡。上述结果充分证实,本研究分离的毒株为伪狂犬病病毒,随之将其命名为伪狂犬病病毒FJNP株。本研究结果丰富了福建省伪狂犬病流行病学资料,为开发猪伪狂犬病病毒新型疫苗提供了依据。     

猪伪狂犬病病毒HLJ8株的分离与鉴定

2013年黑龙江省某猪场发生仔猪死亡并且伴有神经症状,采集死亡猪脑组织,经PCR检测、病毒电镜观察,确诊为伪狂犬病病毒(PRV)感染,遂将该毒株命名为HLJ8。进一步对病毒gE基因的序列分析表明,该毒株与2012年的中国分离株在同一个相对独立的分支中,氨基酸序列的同源性在94%~100%之间;与2011年之前分离的毒株的亲缘关系较远。小鼠毒力试验结果表明,高剂量(1×103 PFU/mL)的HLJ8株可以引起小鼠死亡以及皮肤瘙痒等典型的PRV感染症状,但其毒力略低于经典强毒株PRV SC株。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)Fa株为对照,时PRV Fa株TK基因缺失株、PRV Fa株gI/gE双基因缺失株和PRV Fa株TK/gI/gE三基因缺失株进行了细胞培养特性的观察.包括对照毒株在内的4个毒株均按0.5 mL(1×10~6PFU)接种量分别感染IBRS-2、Marc-145、ST、Vero和MDBK等细胞系;选择在接种后第0、8、12、24、36和48 h观察感染细胞的形态学变化.结果显示,这4个毒株在这5种细胞上均能增殖并引起细胞病变,但PRV基因缺失株引起的病变程度均不及Fa株.表明,PRV的不同毒力基因对其致细胞病变能力不同.     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过"鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞"接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gC基因的分子特征及其对小鼠的毒力试验

为了阐明猪伪狂犬病病毒(PRV)流行毒株gC基因的分子特征及其对小鼠的毒力,对来自不同年代分离的6株PRV流行毒株进行了gC基因分子变异特征分析,通过接种BALB/c小鼠检验毒株的毒力。对临床病例分离的6株PRV和30个Gen Bank下载的gC基因序列进行分析表明,这6株PRV与2012年以后流行的毒力增强的变异毒株处于同一分支;这些毒株的氨基酸同源性为98.7%~100%,而与经典的PRV-SC毒株的氨基酸同源性仅为93.2%~94.0%。PRV毒株g C蛋白第52~70位氨基酸为高变区,尤其第64~70位出现7个氨基酸(AAASTPA)插入。对gC蛋白糖基化位点分析表明,PRV变异毒株较经典毒株增加了6个O-连接糖基化位点,且gC蛋白B细胞表位出现3处突变,分别为P69R、P80Q和N83G。gC蛋白上硫酸乙酰肝素结合域(HBD)出现2处突变,分别为HBD1第5位氨基酸由经典毒株的P突变为Q,HBD3的第3位氨基酸由Y突变为C。用分离的6株PRV接种BALB/c小鼠试验显示,PRV-HRB和PRV-SH毒株半数致死量(LD50)均为1×10~(3.21)/mL,PRV-DL、PRV-JL及PRV-GZL的LD50为1×10~(3.75)/mL,PRV-JF的LD50为1×10~(4.32)/mL。上述结果阐明了PRV流行毒株g C基因的分子特征及其对小鼠的毒力,为该病毒的致病机制研究提供了科学依据。     

伪狂犬病病毒HNX株增殖特性及其致病性的研究

将伪狂犬病病毒(PRV)HNX株和经典Ea株分别接种PK-15和Vero细胞,观察细胞病变情况,用TCID50法检测HNX株的病毒效价并绘制一步生长曲线。将15头50日龄的PRV阴性仔猪随机平均分为3组,其中2组分别滴鼻接种1mL 107 TCID50的HNX株和Ea株病毒,第3组滴鼻接种1mL DMEM培养液作为空白对照。结果显示,HNX株和Ea株在这2种细胞中产生的CPE差异明显。病毒一步生长曲线显示,HNX株早期增殖速度明显比Ea株快。动物试验结果显示,接种HNX株的试验猪临床症状典型,体温和排毒量明显高于Ea株组,HNX株的致死率为60%(3/5),Ea株的致死率为0。HNX株造成的病理损伤比Ea株严重。结果表明,HNX株能快速适应宿主细胞,相关增殖特性发生明显改变,并且对仔猪的致病性明显增强。     

伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合人工感染仔猪排毒的检测

为了解伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染仔猪后不同时间点的病毒载量及排毒规律,将34头健康仔猪分为4组,第1~3组分别为人工接种PRV、PCV2和PRV+PCV2组,第4组为空白对照组。分别在接种后第3、7、14、21、35天采集试验仔猪的鼻拭子和肛门拭子,用Taq Man荧光定量PCR(q PCR)对其进行定量检测,并分析仔猪排毒的变化规律。结果,接种后第3天,3个试验组仔猪肛门拭子、鼻拭子中均分离到PRV或PCV2;其中PRV单独感染后的病毒载量在第14天达到峰值331.67 copies/L;PCV2单独感染后的病毒载量在第3天达到峰值10 742.01 copies/L;PRV+PCV2混合感染后鼻拭子和肛门拭子的PRV分别在第14天和第7天达峰值980.96 copies/L和2 230.056 copies/L;鼻拭子和肛门拭子PCV2在感染后第14天达到峰值69.413 copies/L和271.72 copies/L;混合感染仔猪于感染后第8~14天发生死亡。3个感染组之间无论是肛门拭子还是鼻拭子,PRV、PCV2病毒载量均差异显著(P0.05)。上述结果表明,PRV单独感染、PCV2单独感染和二者混合感染均对仔猪造成严重危害,除引起仔猪发病死亡外,这2种病毒均能通过呼吸道和消化道向外排毒。     

猪伪狂犬病病毒SX-2018变异株的分离鉴定及其致病性研究

本研究从疑似暴发伪狂犬病(pseudorabies,PR)猪场死亡的仔猪中分离到1株病毒,经组织病理学剖检、PCR试验、Western-blot分析,将其鉴定为伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),遂被命名为SX-2018,该病毒在MDCK细胞上具有较强的适应性。将SX-2018株gE基因的序列与国内外21株PRV参考序列进行同源性比较,结果显示,SX-2018株gE基因与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%～99.9%,氨基酸同源性为94.5%～100%。遗传进化分析显示,SX-2012株与我国近几年新分离的猪伪狂犬变异毒株处于同一分支;并且与经典株相比,gE蛋白在第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。为了进一步探讨SX-2018毒株的致病性,将SX-2018株和Min-A株分别感染BALB/c小鼠,分析两组小鼠的发病特征和组织损伤情况;结果显示,SX-2018组的小鼠死亡时间早于Min-A组;并且Min-A组小鼠的肺脏主要表现为间质性肺炎,而SX-2018组的小鼠以出血性肺炎为主。荧光定量PCR分别检测两组小鼠肺脏内PRV gI基因和炎症相关因子的变化;结果显示,SX-2018组小鼠肺组织内的gI基因以及炎症相关因子的mRNA水平显著地高于Min-A组小鼠。以上结果表明,本文成功分离到1株PRV变异毒株,并且与PRV经典株Min-A株相比,新分离的变异毒株可以诱导不同程度的病理损伤和炎症反应。     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。     

猪源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

从福建省某猪场疑似猪瘟的发病仔猪采集病料,处理后接种于牛肾细胞(MDBK),分离到1株病毒,并对其进行了系统鉴定.结果显示,病料接种MDBK细胞72 h后产生了明显的细胞病变;该分离毒株可以被牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清中和,中和效价为1:106;该分离毒株对氯仿、乙醚、胰酶、酸敏感,不耐热,56℃30 min...     

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定

2016年3月江苏某猪场发生了哺乳仔猪腹泻疫情,导致大部分哺乳仔猪严重腹泻和死亡。为确定此次腹泻的病原,从该猪场采集了6份仔猪腹泻样品,利用RT-PCR方法对可引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三种主要腹泻病毒进行了检测。结果显示,6份样品均呈现PEDV阳性,而TGEV和PoRV为阴性。无菌处理6份阳性样品后分别接种于Vero细胞,进行病毒分离培养;结果,6份样品中仅JSqd3/2016接种后可产生明显细胞病变,且连续传至第5代时细胞病变仍稳定存在。对JSqd3/2016分离株利用针对PEDV S蛋白的特异单抗进行间接免疫荧光鉴定结果显示,PEDV S蛋白单抗能够特异性识别JSqd3/2016分离株感染的Vero细胞。对JSqd3/2016-F5分离株S基因和ORF3基因进行克隆测序和序列比较分析结果显示,分离获得的JSqd3/2016毒株与目前的流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株相比S基因存在较大变异,氨基酸同源性为93.0%~93.3%。本研究结果证实,PEDV变异毒株感染是该猪场仔猪腹泻疫情的主要病因。     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

宿主细胞基因序列插入亚洲1型口蹄疫病毒导致病毒对牛的致病性减弱的研究

1株Asia 1型口蹄疫疫苗毒株在BHK21悬浮培养细胞中传代时与宿主BHK21细胞m RNA重组,导致VP1第206位与第207位氨基酸之间插入了VDLV序列,该插入突变使得疫苗免疫效果大幅下降,不能产生有效保护。比较发现,含12 nt插入序列的变异毒株(Vac-Asia1-VDLV)与亲本毒株(Asia 1/HN/06)在BHK21细胞上的生长曲线存在较大差异,变异毒株可感染CHO-K1,pgsA-745,pgsB-618,pgsD-677细胞,毒价可达到1×105PFU/mL以上,而亲本毒不能感染CHO类细胞并产生蚀斑。动物试验结果显示,乳鼠半数致死量(LD50)与亲本毒株相比变化不明显。但牛感染试验表明,大剂量(1×107LD50)接种牛舌面,Vac-Asia1-VDLV不引起体温反应和其它临床症状,荧光定量PCR检测鼻拭子和血液时未发现病毒,而Asia 1/HN/06引起典型的口蹄疫症状,鼻拭子和血液中检出病毒。上述试验结果表明,与亲本毒相比,变异毒株Vac-Asia 1-VDLV对牛的致病性明显降低。     

猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的安全性及效力试验

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒株能在Marc-145细胞上正常增殖,经克隆纯化后测得其毒价为107.41TCID50/mL.克隆株对乳鼠、低日龄乳猪和妊娠母猪具有很高的安全性;3日龄乳猪用10-1、10-2稀释的病毒液接种后,能抵御105.8TCID50/mL的PRRS强毒攻击;后备母猪在接种克隆株病毒后于妊娠85 d用PRRS强毒攻击,结果不发生流产;妊娠母猪接种克隆株病毒原液后,足月产仔时其后代无死产、弱仔、干尸化现象.临床应用PRRS弱毒苗12万头份,证明克隆株弱毒苗在控制仔猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍方面安全、有效.     

猪伪狂犬病病毒变异株R13028株生物学特性及致病性的研究

为了解天津地区猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的流行情况,2013年从疑似PRV病例中分离纯化获得一株野毒株(R13028株),对其gC基因进行测序及分析,并研究病毒的细胞增殖特性和致病性.结果 显示,R13028株与参考毒株相比在139位至189位缺失51 bp核苷酸,遗传进化分析显示该...