犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立

本研究针对野毒株与疫苗株的H基因设计特异性引物,通过优化反应体系和反应程序,建立了一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法。检测结果表明,该方法能特异性地检测CDV野毒株,与CDV疫苗株、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒均无交叉反应。其标准曲线的相关系数达0.987。检出敏感性达6.22×101copes/L,比常规PCR检测方法高100倍。应用本方法检测了42份临床疑似CD样品,其中41份为野毒株感染,随机选取15份阳性样本进行H基因克隆测序,通过进化树分析显示它们均属于Asia-Ⅰ型,与疫苗株H基因相比同源性较低,核苷酸的同源性在90.3%~91.3%之间,氨基酸同源性在96.3%~97.2%之间。该方法的建立为临床上CDV的鉴别检测提供了依据。     

快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25 min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25 min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

猪主要免疫抑制性疾病四重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测猪巨细胞病毒(PCMV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细环病毒(TTV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的四重PCR检测方法,本研究设计合成了4对特异性扩增引物,在系统性地优化反应体系、反应条件的基础上,分别对其特异性和敏感性进行验证,建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR方法,并对131份临床样品进行了检测。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度高,对PRRSV、PCV2、TTV和PCMV的最低检出量分别为2.4×10~3copies/μL、3.5×10~5copies/μL、6.2×10~2copies/μL、5.6×10~3copies/μL。以单一PCR方法对所有临床样品进行检测后发现,检测结果与多重PCR检测结果一致,证明该多重PCR方法可以用于这4种病原的快速检测。     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

基于免疫彩色纳米微球的犬瘟热病毒抗体检测凝集试验

为建立以红色聚苯乙烯纳米微球为载体,快速检测幼犬犬瘟热病毒(CDV)母源抗体或免疫犬抗体水平的间接凝集试验,本研究表达纯化了CDV H截短的重组蛋白rsH2,并以rsH为致敏原与纳米微球偶联制备了免疫彩色纳米微球;通过间接凝集反应条件的优化,特异性、敏感性、稳定性试验和临床样品的检测,建立了一种快速检测CDV抗体的间接凝集试验。特异性结果显示,致敏微球仅与CDV阳性血清发生凝集反应,不与狂犬病病毒、犬腺病毒和犬细小病毒的阳性血清发生凝集反应,特异性强;凝集试验可检测血清中和抗体的最低效价为1∶35;不同批次制备的致敏微球和4℃保存90 d的致敏微球的凝集反应特异性一致,凝集程度无明显差异,重复性稳定性好;该凝集试验对45份血清样品的检测结果与CDV抗体检测试剂盒检测结果的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的检测CDV抗体的间接凝集试验具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为CDV抗体检测提供了一种快速、简便、准确、经济的检测方法。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的有关基因序列,设计4对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gH基因、PRRSV的ORF7基因和CSFV的5′UTR基因的目的片段,建立了同时检测4种病毒的多重PCR。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对这4种病毒的最低核酸检出量分别为48.1pg(PCV2)、29.6pg(PRV)、54.2pg(PRRSV)和62.8pg(CSFV)。该方法可同时扩增440bp(PCV2)、359bp(PRV)、321bp(PRRSV)和186bp(CSFV)的特异性片段,而对牛流行性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒的检测结果均为阴性。多重PCR与单一PCR的符合率为100%。结果表明,该方法可用于这4种病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒半巢式PCR检测方法的建立

为建立快速、敏感的蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)检测方法,根据GenBank中已登录的蜱源LCMV NP基因序列设计半巢式PCR引物,通过优化反应条件建立半巢式PCR检测方法。结果显示,用该方法能扩增出248 bp的目的片段,与LCMV序列(MG554174)的同源性为100%。特异性试验结果显示,该方法对蜱传脑炎病毒、发热板血小板减少综合征病毒、阿龙山病毒的基因扩增无条带。敏感性试验结果显示,该方法最低可以检出0.45×10~2copies/μL的蜱源LCMV NP蛋白基因,是普通PCR的1 000倍。对总数为150只森林革蜱、草原革蜱和全沟硬蜱样品的检测发现,半巢式PCR、普通PCR的检出率分别是18%和0。蜱源LCMV半巢式PCR方法的建立为蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎的防控提供了技术支持。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。     

PEDV-TGEV-RV三重PCR检测方法的建立

根据G en Bank中已登陆的猪流行性腹泻病毒(PED V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PEDV的N基因、TGEV的M基因、RV的VP7基因的目的片段;通过优化反应体系,建立了同时检测PEDV、TGEV、RV的三重PCR检测方法。敏感性和特异性试验的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为39.5 pg(PEDV)、38.1 pg(TGEV)和51.6 pg(RV)。该方法可同时扩增477 bp(PEDV)、263 bp(TGEV)、355 bp(RV)的特异性基因片段,而对猪瘟病毒(CSF V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等病毒的检测结果均为阴性。三重PCR与单一PCR的符合率为100%。上述结果表明,该方法的建立对于这3种病毒的临床快速检测与流行病学调查具有十分重要的意义。     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立

为建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒(CPV)的TaqMan荧光定量PCR方法,通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测。结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增。该方法检测的灵敏度达101copies/L,该方法的批内变异系数为0.09%~1.30%,批间变异系数为0.57%~0.94%,重复性良好。核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR的最低检测浓度均可以达到101 copies/L,且原液荧光定量PCR的产物浓度约为核酸荧光定量PCR的7倍,提示核酸在提取过程中有大量的损耗。对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板的阳性符合率均为100%,核酸法与原液法的符合率为100%。因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

犬冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应;敏感性试验结果表明,它的最低检测限为4×10~1~5×10~1 copies/L,高于常规RT-PCR方法 10倍左右;批内和批间重复试验的变异系数均小于1.20%。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对76份临床样品进行检测;结果显示,普通RT-PCR的阳性率为69.7%,实时荧光定量RT-PCR的阳性率为78.9%。对于60份阳性病料,随机选择2份病料进行病毒分离,用阳性血清中和其他外源病毒后都出现了CPE,进行RT-PCR扩增后测序,结果证实为CCoV。以上结果表明,本研究建立的方法可以为犬冠状病毒病的快速诊断及流行病学调查提供技术手段。     

非洲猪瘟病毒NanoPCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、适用于大批量样品检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究使用金纳米颗粒与传统PCR技术相结合,针对ASFV中P72保守序列,建立了一种新的ASFV的NanoPCR分子检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果表明,对于相关病毒,包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV),NanoPCR分析均未发现交叉反应。与常规PCR相比,NanoPCR灵敏度更高,每个反应的检出限为2.86×10~3copies/μL,而常规PCR检出限为2.86×10~4copies/μL。用建立的方法对23份临床样品进行检测,结果 ASFV的阳性检出率为60.86%。综上所述,本研究开发的灵敏、特异性的NanoPCR方法可广泛应用于ASFV感染的临床诊断和现场监测。