近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征

用RT-PCR方法从2007年12月在安徽境内发生的两起传染性腔上囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡腔上囊组织样品AH1与AH2中扩增出了传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析表明,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1 350 nt,编码450 aa,七肽基序均为S-W-S-A-S-G-S,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、QI、、D、AI、和S,具有IBDV强毒的分子特征,AH1和AH2感染的20日龄雏鸡产生明显IBD病变,死亡率为25%(1/4)。同源性分析表明,26个血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.7%～99.6%和95.5%～100%,不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上,26个血清Ⅰ型IBDV毒株可分为数组,其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组,毒株之间的亲缘关系与分离地区或分离时间没有明显的联系。AH1和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列的差异率分别为5.3%和5.2%,这也进一步佐证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫苗免疫预防失败的主要原因。     

三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的"三联体"基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。     

珍珠鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离及其VP2基因的分子遗传特征

为了确诊某动物园珍禽的疑似传染性法氏囊病(IBD)疫情,通过RT-PCR和病毒分离的方法对采集的病料进行鉴定,并对病毒的VP2基因进行分子和遗传分析。结果显示,分离到了1株传染性法氏囊病病毒(IBDV),其VP2基因与荷兰株D6948的亲缘关系最近,达到98.8%,同属于超强毒株分支;VP2蛋白关键氨基酸位点及七肽基序均符合超强毒的分子特征,从分子水平上证实此次珍禽疫情是由超强IBDV感染导致的;同时本试验首次发现IBDV导致白鹇和孔雀的发病死亡,说明IBDV的感染谱正在不断拓宽。结果表明,加强野生禽类IBD的分子流行病学研究,对IBD的防控具有重要意义。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒 (IBDV )YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析 ,并和相关毒株进行了比较。结果表明 ,YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有 92 .5 %和 91.8% ,与超强毒株UK6 6 1的核苷酸和氨基酸同源性均为97.6 % ,而与当地鸡群中分离的超强毒株HN94 2的核苷酸和氨基酸同源性则高达 98.1%和98.4 % ,该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2 基因的克隆和序列分析

根据已发表的52/70株传染性腔上囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IBDV VP2基因的引物.以超强毒IBDV(vvIBDV)致弱株GZ20基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于pUC119质粒上,得到重组pUC119质粒.并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株PBG98和弱毒株CU-1非常相似,而与经典强毒株、超强毒株和变异株相差较大.这提示该致弱株属于标准血清Ⅰ型弱毒株.     

表达流行毒株VP2蛋白的IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2的构建及其免疫效力的评价

为应对传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异毒株及超强毒株(vvIBDV)等突发疫情的出现,解决传统疫苗株筛选费时费力的难题,在流行病学调查的基础上,克隆了超强毒株HLJ0504的VP2基因,并突变细胞嗜性决定氨基酸位点(Q253H/A284T),用其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,成功获得1株表达流行vvIBDV VP2蛋白的重组病毒rGtHLJVP2。体内、外复制动力学研究表明,该重组病毒与亲本病毒Gt的复制能力相当。动物试验结果表明,该重组病毒对接种鸡无明显致病性,接种鸡法氏囊指数均在0.7以上,法氏囊无明显萎缩现象。该重组病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答,其抗体水平明显高于亲本毒,能够完全抵抗vvIBDV的攻击。另外,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究结果为新型传染性法氏囊病疫苗的研发奠定了基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重要意义。     

Bac-to-Bac系统双表达蛋白IBDV VP2-IL-18免疫原性的研究

把用Bac-to-Bac系统单表达或双表达的蛋白IL-18、传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2和IBDV VP2-IL-18与IBD疫苗同时腿部肌肉多点注射免疫14日龄SPF鸡,14d后加强免疫1次;免疫前、后均采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量和ELISA抗体效价。二免后第21天用vvIBDV-GX8/99毒株进行攻毒。结果显示,VP2-IL-18、VP2+IL-18、IL-18+IBD疫苗、VP2分别免疫雏鸡后均能促进CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖和抗体水平的增加,能明显增强攻毒保护率,但VP2-IL-18免疫组要优于VP2+IL-18混合免疫组及其他免疫组和对照组,差异显著(P0.05)。上述结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18不仅能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,而且还可以产生较高保护率,为新型IBD疫苗的研制奠定了基础。     

鸡传染性腔上囊病病毒的反向遗传操作

传染性腔上囊病病毒 (infectiousbursaldiseasevirus ,IBDV)是引起鸡传染性腔上囊病 (IBD)的病原。IBD是严重危害养鸡业的三大传染病之一 ,除直接引起易感鸡发病及死亡外 ,更重要的是破坏机体的免疫器官 ,引起严重的免疫抑制 ,使鸡群对其他病原的易感性增加 ,并导致疫苗免疫失败 ,从而给世界养鸡业造成了巨大的经济损失。IBDV属于双链RNA病毒科禽双RNA病毒属的成员[1] ,有 2个血清型 (1型及 2型 ) ,但只有血清 1型病毒有致病性 ,同时血清 1型在毒力上存在着很大的差异 ,可分为古典强毒株、弱毒株、变异株和超强毒株。超强毒株的抗原…     

福建地方鸡B亚群禽白血病病毒的分离鉴定

在对福建某地方鸡群进行禽白血病流行病学调查的基础上,对疑似病例进行p27抗原检测,取阳性血清接种DF-1细胞分离病毒。采用PCR及间接免疫荧光试验鉴定其亚群并对其gp85基因进行序列分析。结果显示,分离株FJ15HT0的B亚群特异性PCR检测呈阳性;IFA显示感染该毒株的DF1细胞中可检测到p27抗原,而未检测到J亚群特异性囊膜蛋白的表达;对该毒株gp85序列进行分析,发现与多株ALV-B参考毒株氨基酸序列的同源性为91.6%~98.8%,其中与GX10LS01株同源性最高为98.8%,与A、C、D、E亚群同源性在69.4%~84.2%,与J亚群同源性仅为36%~38%。该研究首次分离并鉴定河田鸡群中ALV-B,为后续的研究奠定了基础。     

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病(MD)流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒(MDV)Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析.结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%～100%,与MDV Ⅰ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%～99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致.提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征.     

H9N2亚型禽流感病毒华东分离株的生物学特性及遗传进化分析

对从华东地区分离的6株鸡源H9N2亚型禽流感病毒进行了生物学特性及血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的分子遗传进化分析.发现这6株病毒对SPF鸡无致病性,IVPI均为0,可被单克隆抗体4E7分为2个亚群.序列分析表明,这6株病毒的HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,Ck/HD/16/07和Ck/HD/112/05的潜在糖基化位点与其他4株不一致;NA基因为N2亚型,其中4个毒株的茎部缺失3个氨基酸,而另2个毒株无缺失.     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

表达IBDV AH1株VP2嵌合法氏囊素三肽基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫功能分析

为研究传染性法氏囊病(IBD)重组火鸡疱疹病毒(HVT)的构建策略,以HVT FC126基因组非必需区UL44~UL45为插入位点,构建带有大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因序列(gpt)标记的HVT转移载体质粒pUAB-gpt。然后构建表达IBDVAH1株VP2嵌合法氏囊素三肽(BS10)表达盒并克隆入pUAB-gpt,获得转移载体质粒pUAB-Pec-BS10-VP2-Egpt。将该转移载体与HVT DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过间接免疫荧光试验(IFA)、IBDV抗体夹心ELISA检测、Western-blotting分析,结果显示,获得了表达VP2基因的重组HVT病毒rHVT-Pec-BS10-VP2。将该重组病毒免疫1日龄SPF鸡,免疫后第14天,鸡群可以检测到IBDV抗体。免疫后第21天,脾淋巴细胞增殖活性反应显著。证明IBD重组火鸡疱疹病毒构建成功。     

传染性腔上囊病病毒与禽腺病毒混合感染的分子鉴定

应用设计的分别针对传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因高变区(vVP2)和Ⅰ群禽腺病毒(FAV)六邻体(hexon)蛋白基因的特异性PCR引物,对临床疑似IBD病例的2只鸡的腔上囊样品和泄殖腔拭子样品分别进行IBDV和FAV的分子检测.结果显示,通过巢式PCR从2份腔上囊样品中均扩增出了471 bp的IBDV vVP2特异性目的片段;Ssp Ⅰ和Sac Ⅰ的酶切分析以及序列测定分析证实,该目的片段属超强毒IBDV(very virulent IBDV,vvIBDV)的特征性序列,与常用疫苗株的亲缘关系较远.从2份泄殖腔拭子样品中均扩增出了900 bp的FAV特异性目的片段;序列测定和遗传进化分析表明,该片段在分子水平上属于血清l型FAV(FAV-1).结果表明,该病例同时感染了vvIBDV和FAV-1.     

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒(IBDV)的致病机理及研制有效的IBDV疫苗,利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子,对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑,通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测,共选出13个单克隆噬菌斑,经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定,确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV Gx(Gen-Bank登录号:AY444873)VP3的氨基酸序列相同,但二级结构上均以β折叠为主,并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实,筛选的是IBDV VP3的模拟表位。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

武汉地区群养鸡传染性法氏囊病的调查

对武汉地区5个养鸡场1990年3月至1990年9月份鸡传染性法氏囊病(IBD)发病情况进行调查,共调查7～60日龄易感鸡21800羽,发病10900羽,发病率为50％;死亡3300羽,发病死亡率为30.28 ％。各鸡场IBD的流行特点各有不同。通过病原分离,获得4株IBDV地方株,其中2株来自免疫IBD的鸡群,证明本省有IBDV强毒流行。用分离的IBDV1∶4囊毒液,接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜(0.2ml/胚),48小时可使48％～80％鸡胚死亡。