广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

14株基因C型鸭甲肝病毒分离株的VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位分析

对14株分离自四川不同地区的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1基因进行了PCR扩增、测序、序列比对分析以及抗原表位分析。结果显示,14株DHAV-C VP1基因核苷酸序列的同源性为92.2%～100%,推导氨基酸序列的同源性为85.8%～100%,与GenBank中的24株DHAV-C VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.9%～99.3%和80.8%～100%。聚类分析显示,四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支,3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支,4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支,它们与其他毒株之间存在一定的遗传距离。DHAV-C VP1蛋白由240个氨基酸组成,是由α螺旋、β折叠和无规则卷曲共同组成的混合型蛋白,VP1蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面可及性均较高,其中212～222位氨基酸区域的亲水性、抗原指数和表面可及性最高,可能是DHAV-C VP1蛋白上的B细胞表位优势区域,为DHAV-C表位疫苗的研究提供了理论依据。结果表明,四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内。     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸。将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%~97.5%,氨基酸同源性为94.3%~99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002。与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100%;与648A株同源性最低,为98.6%。将分离得到的MDV野毒株回归动物实验,分析其对肉鸡品种黄鸡2号的致病性,该分离株攻毒组发病鸡出现瘫痪症状,并发现心脏、肝肿瘤。病理组织学观察可见各组织出现淋巴细胞增生和浸润。致病性结果显示,YL2002攻毒组发病率和死亡率为100%和69.2%。本试验成功分离得到1株MDV强毒株,为广西玉林地区频发的马立克氏病疫情的防控提供了理论基础,也为我国MDV的毒力演化研究提供了参考。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

猪瘟病毒遗传发生关系分析

利用反转录（ＲＴ）及ＰＣＲ扩增并测定了中国猪瘟兔化弱毒（Ｃ－株）兔组织毒、Ｃ－株细胞疫苗毒和近期（１９９７～１９９８年）甘肃省７个地区的１０个流行野毒株的Ｅ２基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：Ｃ－株兔组织毒、Ｃ－株细胞毒和中国５０～６０年代流行的石门强毒株同属于组群１（Ｇｒｏｕｐ１）;近期猪瘟流行毒株同属于组群２（Ｇｒｏｕｐ２）的两个不同的亚组群（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ２．１和２．２）,其流行毒株与疫苗毒株有较大的差异（Ｅ２全基因核苷酸序列同源性８２．２％～８４．３％）,表明猪瘟流行毒株向远离疫苗毒株的方向演变。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因.序列分析表明,该序列全长741 bp,开放阅读框(ORF)为651 bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%.由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因.利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白.将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41 ku的融合蛋白.     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。