犬睾丸肿瘤组织中肿瘤标志物Lin28a和OCT4及P53的表达

睾丸肿瘤细胞起源于生殖细胞和非生殖细胞,生殖细胞来源者主要为成熟的畸胎瘤,非生殖细胞瘤主要包括支持细胞瘤和间质细胞瘤。本研究将贵宾犬的睾丸肿瘤样组织制成石蜡切片,通过HE染色以及免疫组化染色的方法,镜检观察睾丸肿瘤组织的细胞形态以及P53、Lin28a和OCT4等肿瘤发生相关蛋白的表达水平。结果,通过病理切片HE染色显示睾丸肿瘤组织细胞异常增生,导致正常的睾丸管腔结构消失;肿瘤免疫组化检测显示在睾丸曲细精管的支持细胞内OCT4、Lin28a以及P53等肿瘤发生相关蛋白表达呈阴性,而在曲细精管内的生精细胞表达均呈阳性。该结果对于临床上辅助诊断犬的睾丸肿瘤具有一定的参考价值。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

蛋白基因产物9.5在高原黄牛与平原黄牛睾丸中分布情况的比较

为了探索蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)在不同海拔地区黄牛睾丸组织中的分布特征及其与生精功能的关系,采用免疫组织化学SP法观察了PGP9.5在平原地区和高原地区黄牛睾丸组织中的分布特点。结果显示,PGP9.5显著分布于平原黄牛和高原黄牛睾丸Leydig细胞中,间质血管周围或血管壁内为阴性,生精小管内初级精母细胞为阴性,其余生精细胞为阳性;PGP9.5在平原黄牛Sertoli细胞为强阳性表达,而高原黄牛阳性信号有所减弱,仅在Sertoli细胞顶部呈弱阳性表达;PGP9.5阳性信号高原黄牛和平原黄牛表达均在睾丸头和睾丸尾较强,睾丸体最弱。结论:PGP9.5在不同海拔地区黄牛睾丸生精小管及Leydig细胞中均有分布,表明PGP9.5影响精子发生和激素合成等生殖机能活动;PGP9.5在高原黄牛Sertoli细胞中的分布明显较平原黄牛弱,提示高原环境对睾丸生精功能有一定影响。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织 4例和 3月龄绵羊胎肺 2例作为材料 ,对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液 ,进行了绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV)的分离 ,同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明 ,自然感染绵羊肺腺瘤病的 4例病肺组织中都有散在的病毒粒子 ,其直径为 10 0～ 12 5nm ,接种病毒悬液的胎肺细胞从第 2代到第 9代均出现细胞病变 ,但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子 ,而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子     

不同繁殖周期成年牦牛睾丸细胞外基质相关蛋白的分布比较

应用Masson三色染色法、Gomori银浸染色法以及免疫组织化学SP法结合IPP统计分析法,比较了层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)在繁殖期和繁殖间期牦牛睾丸的分布及组织化学特征。结果,不同繁殖期牦牛睾丸间质胶原纤维及网状纤维均较为丰富;繁殖间期牦牛睾丸LN在支持细胞(sertoli cells)和生精细胞表达与繁殖期相近,在间质细胞(leydig cells)表达降低,但其平均吸光度检测无统计学差异(P0.05);ColⅣ在不同繁殖期牦牛睾丸支持细胞和各级生精细胞均有阳性表达,但繁殖期牦牛ColⅣ在近管腔面生精细胞显示有强阳性表达,平均吸光度统计表明繁殖期显著高于繁殖间期(P0.01);HSPG在不同繁殖期牦牛睾丸精原细胞及支持细胞强阳性表达,繁殖间期平均吸光度检测极显著低于繁殖期(P0.01)。上述研究结果表明,高原环境中成年牦牛睾丸间质组织纤维成分随繁殖季节变化并不明显,睾丸组织LN合成与不同繁殖季节间质细胞分泌功能变化相关,繁殖期ColⅣ合成增强更有利于精子生成,HSPG的显著增加主要与精原细胞及支持细胞分化相关。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养与鉴定

为建立一种稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础,采用组织块法培养滋养层细胞,消化差速法纯化细胞,相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点,应用常规HE染色和免疫组织化学染色、透射电镜及PCR技术鉴定细胞来源。结果显示,倒置相差显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上,波形蛋白染色呈阴性;透射电镜可观察到滋养层细胞所特有的结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力,存活率超过95%,细胞活力良好。常规RT-PCR技术可扩增出滋养层细胞所分泌的特有的干扰素蛋白-1基因片段。证实该方法可以有效获得较高纯度的、具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供试验基础。     

槲皮素对己烯雌酚诱导的仓鼠生精细胞氧化损伤的保护作用

为研究槲皮素(Que)对己烯雌酚(DES)诱导的体外培养仓鼠睾丸生精细胞氧化损伤的保护作用,将生精细胞分别用DES和不同浓度(10、20、30μmol/L)的槲皮素处理,用倒置显微镜观察生精细胞的生长状况,用MTT法测定生精细胞的存活率,用分光光度法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量。结果显示,Que显著抑制了DES引起的生精细胞损伤,除低剂量组差异不显著外,中、高剂量组细胞存活率显著上升(P0.01);Que显著提高了培养液中SOD的活性和细胞中GSH-Px的含量(P0.01)。说明槲皮素可有效对抗自由基,抑制脂质过氧化,减弱DES导致的生精细胞损伤,提示Que是缓解环境雌激素生殖毒性的有效成分之一。     

虹鳟鱼传染性胰腺坏死的初步调查

本文对甘肃省某养殖场虹鳟鱼稚鱼大批死亡的病因进行了调查。通过流行情况分析、发病症状、病理解剖变化、病毒分离培养和电镜观察,初步诊断该病为虹鳟鱼的传染性胰腺坏死(Inf- ections Pancreatic Necrosis)。在病鱼的组织悬液中经电镜观察发现了病毒颗粒。病料除菌滤液能引起CHSE细胞和RTG-2细胞的严重病变。在CHSE细胞接种除菌滤液的培养物中,经电镜观察发现了同样的病毒颗粒。病毒颗粒呈正二十面体,无囊膜,有92个壳粒,直径约为50～60nm。     

乳牛前脂肪细胞原代培养过程中ADPN基因和HSL基因表达水平的检测

选取犊牛大网膜脂肪组织,进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养,在细胞接种后第4、6、8、10、12、141、6 d分别提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测了体外培养的犊牛前脂肪细胞不同时期ADPN基因mRNA和HSL基因mRNA的表达情况。结果表明,单层培养的脂肪细胞在第4、6、8、10、12、141、6 d,ADPN基因mRNA的表达水平呈先下降后升高的趋势,而HSL基因mRNA的表达水平则呈下降趋势。     

KiSS-1基因在黄牛精子发生中的表达

为探讨亲吻素在黄牛精子发生中的生理功能,并为家畜生殖生理学研究提供参考,运用免疫组织化学SABC染色法并采用Image Pro-Plus 6.0软件,对成年黄牛睾丸中KiSS-1的表达及分布特征进行了研究。结果显示,在成年黄牛睾丸的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、早期精子细胞及间质细胞中均发现KiSS-1阳性反应产物,其各阳性细胞积分光密度(IOD)值的大小顺序为IOD初级精母细胞>IOD间质细胞>IOD次级精母细胞>IOD精原细胞>IOD早期精子细胞,而阳性产物在晚期精子细胞、精子和支持细胞及睾丸间质血管上未被发现;在部分间质细胞周围可见大量的KiSS-1免疫阳性反应产物,而在其他阳性细胞周围未见此现象。结果证实,KiSS-1基因在黄牛精子发生中发挥着重要作用,尤其在精原细胞的有丝分裂和精母细胞的减数分裂中可能发挥着非常重要的作用,而且间质细胞具有向睾丸微环境中分泌KiSS-1的功能。     

猪前脂肪细胞分化过程中RETN基因的表达

为探讨猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素基因(RETN)表达水平的变化规律,从1日龄仔猪皮下脂肪组织分离前脂肪细胞,于DMEM/F12培养基中培养3、5、7、10d后收获细胞。通过油红O染色法观察前脂肪细胞分化,并用实时荧光定量RT-PCR检测前脂肪细胞分化过程中RETN基因表达水平的变化。结果,在前脂肪细胞分化过程中,RETN基因表达水平显著下降(P<0.01),细胞形态亦发生相应变化,即细胞变圆,细胞内脂肪滴体积增大。结果表明,RETN基因与前脂肪细胞脂肪代谢调节有关,其表达水平下调能促进前脂肪细胞分化。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

二甲苯对小鼠卵巢组织损伤的研究

为了研究二甲苯对小鼠卵巢组织的损伤作用,以健康成年SD雌性小鼠作为实验动物,分3个试验组(低、中、高剂量组)和1个对照组,试验组腹腔注射不同剂量(按体重0.125、0.25、0.5mL/kg)的二甲苯,对照组每天腹腔注射生理盐水。采用石蜡切片和HE染色技术观察二甲苯染毒后小鼠卵巢组织结构的变化;采用分光光度法测定小鼠卵巢组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量。结果表明,二甲苯染毒导致小鼠卵巢发生萎缩,中、高剂量组的卵泡内都有黑色颗粒,且随二甲苯剂量的增加其病理变化更加明显;中、高剂量组卵巢组织的SOD活性与对照组相比显著下降,而MDA含量显著升高。证实,二甲苯对卵巢组织具有明显的损伤作用,且表现出明显的剂量效应。     

幼年牦牛松果体的光镜和电镜观察

利用光镜和电镜技术对幼年牦牛松果体的组织形态结构特征进行了研究。结果表明,光镜下,幼年牦牛松果体由松果体细胞、少量的神经胶质细胞、毛细血管和神经等组成。电镜下,松果体细胞的电子致密度低,细胞质内含有丰富的线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基复合体、微管、微丝和核糖体,典型异质细胞器突触带呈球形,多位于质膜附近。神经胶质细胞内的线粒体丰富,胞体突起呈球形膨大伸入到松果体细胞之间。松果体细胞以及神经胶质细胞间均存在突触和连接复合体。牦牛松果体内的毛细血管为连续型,远腹侧血管周围可见色素细胞。     

子宫内膜炎病牛子宫内膜的超微结构观察

采用透射电镜和扫描电镜技术对产后6～10d的健康及患急性子宫内膜炎的西门塔尔牛进行子宫内膜的超微结构观察,探讨了奶牛患子宫内膜炎时子宫内膜超微结构的变化特征。结果表明,子宫内膜炎病牛的子宫内膜局部严重脱落,甚至可见子宫肌层,表面附着组织碎片,可见较多球菌、杆菌附着;子宫内膜基质细胞破损、细胞器外溢,腺细胞线粒体肿胀,肥大细胞颗粒数量减少、有空泡形成,淋巴细胞粗面内质网扩张,巨噬细胞核空化、胞质内有较多吞噬体;对照组子宫内膜表面轻度破损,但整体内膜结构相对完整,MC颗粒较多、分布均匀。证实,牛患子宫内膜炎时子宫内膜的细胞呈现缺血、缺氧性变化,说明子宫局部血液循环障碍,氧及营养物质供应不足,子宫内膜的屏障作用降低,病原菌大量增殖导致子宫内膜炎。     

鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚,传3代,取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞(DEF),传代培养至有细胞病变出现,并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示,第1代接毒细胞培养至120 h出现变圆、脱落,并形成少量蚀斑,第2代培养至96~120 h,DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑,第3代培养至72~96 h,DEF出现典型蚀斑;此后可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于72~96 h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高,由第1代的102.75增加到第10代的106.82,最高毒价出现于96 h,该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察,可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形,大小为60~75 nm,无囊膜,具有双层衣壳。结果证实,DSHDV强毒株已经适应了DEF,传代后可获得较高的病毒效价。